绵羊卵母细胞CD9对其冻融后发育能力的影响

发布时间：2017-10-13 03:17

  本文关键词：绵羊卵母细胞CD9对其冻融后发育能力的影响

  更多相关文章： CD9 绵羊卵巢 卵母细胞 体外成熟 体外受精 免疫组化 免疫印迹 实时荧光定量PCR

【摘要】：哺乳动物卵母细胞冷冻保存对生物学和人类医学的研究与发展具有十分重要的价值,可为哺乳动物种质资源长期保存、人类辅助受精技术等生物技术的所需试验提供有效技术手段。但是,卵母细胞解冻后难以与精子结合、融合受精,其主要原因可能是卵母细胞在超低温冷冻保存过程中膜蛋白等结构发生不可逆变化,其中跨膜蛋白的变化有可能引起精卵不能粘附在一起或精子不能穿透卵母细胞的质膜。CD9属于四跨膜蛋白超家族成员之一,在多种组织、细胞上广泛表达,参与精卵结合和融合等重要生命活动。本研究以绵羊为模型动物,采用免疫荧光染色法、实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法对冷冻前后GV期和MⅡ期卵母细胞CD9的分布进行定量定位分析；通过体外受精技术,探讨卵母细胞冷冻前后CD9表达量对精卵结合和融合能力的影响。本试验的主要研究结果如下：1 本研究收集和培养成熟的GV期和M Ⅱ期卵母细胞分别随机分为新鲜组和冷冻组。采用EG、DMSO和PROH联合冷冻保护剂的冷冻液进行冷冻不同发育期卵母细胞,探讨冷冻对卵母细胞发育能力的影响。结果显示,经过冷冻解冻后GV期卵母细胞成熟率(31%)显著低于新鲜组的(75%)(P0.05)。细胞形态观察结果表明,冷冻解冻后GV期和M Ⅱ期卵母细胞形态正常率分别为55%和70%,新鲜GV期和M Ⅱ期卵母细胞形态正常率分别为92%和90%,两组之间差异显著(P0.05)。2 采用免疫组织化学技术检测CD9蛋白在绵羊卵巢组织上的定位表达发现,CD9在卵泡壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和细胞膜上均有表达。并且原始卵泡时期即可检测到CD9荧光信号,随着卵泡的发育成熟,荧光信号逐渐增强,到达成熟卵泡时荧光信号达到最强。3 用实时荧光定量PCR检测CD9 mRNA表达水平。结果显示,新鲜MⅡ期卵母胞中CD9 mRNA的表达显著增高(P0.05),其次为冷冻M Ⅱ期卵母细胞中的表达量(P0.05),冷冻GV期卵母细胞CD9 mRNA的表达量最少(P0.05)。免疫印迹法检测CD9蛋白水平上的表达量趋势和在冷冻解冻过程中GV期和M Ⅱ期卵母细胞CD9荧光显示趋势都与mRNA水平上的表达量趋势一致,即新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9表达量最多,其次为冷冻MⅡ期卵母细胞中的表达,冷冻GV期卵母细胞上表达量最少。4 经体外受精试验检测CD9在每卵粘附精子数及精子穿透率中的影响。结果显示为冷冻GV期经IVM-IVF后粘附数和穿透率分别为2.9±0.6,34%；M Ⅱ期卵母细胞经冷冻解冻-IVF的数据为3.5±0.1,41%。以上两组实验结果都显著低于对照组的粘附数和精子穿透率(6.0±0.5,78%)(P,0.05)。
【关键词】：CD9 绵羊卵巢 卵母细胞 体外成熟 体外受精 免疫组化 免疫印迹 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语表11-12
• 1 前言12-22
• 1.1 四跨膜蛋白超家族14
• 1.2 四跨膜蛋白CD9结构及分布14-16
• 1.3 四跨膜蛋白CD9与受精关系16-17
• 1.4 四跨膜蛋白家族与Izumo17-18
• 1.5 绵羊卵母细胞超低温冷冻保存研究18-19
• 1.6 本研究目的意义19-20
• 1.7 试验主要内容与技术路线20-22
• 2 超低温冷冻对绵羊体外成熟卵母细胞的形态学和成熟影响22-27
• 2.1 试验材料22
• 2.1.1 组织样品22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 主要仪器设备22
• 2.2 方法22-24
• 2.2.1 试剂配制22-23
• 2.2.2 卵母细胞的采集和体外成熟培养(IVM)23
• 2.2.3 卵母细胞成熟鉴定23
• 2.2.4 卵母细胞的冷冻保存23
• 2.2.5 卵母细胞的解冻2.1.2主要仪器设备23-24
• 2.3 统计分析24
• 2.4 结果与分析24-25
• 2.5 讨论25-27
• 3 CD9在绵羊卵巢组织中的定位表达27-31
• 3.1 试验材料27-28
• 3.1.1 组织样品27
• 3.1.2 主要试剂27
• 3.1.3 主要仪器设备27-28
• 3.2 方法28
• 3.3 结果与分析28-29
• 3.4 讨论29-31
• 4 冷冻对卵母细胞CD9的影响31-42
• 4.1 试剂材料31-32
• 4.1.1 细胞收集31
• 4.1.2 主要试剂31
• 4.1.3 主要仪器设备31-32
• 4.2 方法32-35
• 4.2.1 卵母细胞总RNA的提取32
• 4.2.2 总RNA反转录合成cDNA32-33
• 4.2.3 实时荧光定量PCR33-34
• 4.2.4 卵母细胞CD9免疫荧光染色34
• 4.2.5 提取卵母细胞CD9蛋白34
• 4.2.6 卵母细胞CD9蛋白Western blot检测34-35
• 4.3 统计分析35
• 4.4 结果与分析35-39
• 4.4.1 总RNA质检及Q-PCR检测35-36
• 4.4.2 实时荧光定量PCR结果36-37
• 4.4.3 免疫印迹结果37-38
• 4.4.4 CD9蛋白免疫荧光染色结果38-39
• 4.5 讨论39-42
• 5 冷冻对精卵结合的影响42-46
• 5.1 试验材料42-43
• 5.1.1 组织样品42
• 5.1.2 主要试剂42
• 5.1.3 主要设备42
• 5.1.4 主要试剂的配制42-43
• 5.2 方法43
• 5.2.1 卵母细胞的采集及成熟43
• 5.2.2 体外受精43
• 5.2.3 检测粘附率43
• 5.2.4 检测穿透率43
• 5.3 统计分析43-44
• 5.4 结果与分析44
• 5.5 讨论44-46
• 6 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-54
• 作者简介54

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