猫杯状病毒的分离鉴定及其细胞传代

发布时间：2017-10-13 14:19

  本文关键词：猫杯状病毒的分离鉴定及其细胞传代

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【摘要】：猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是杯状病毒科的成员,是引起猫科动物疾病的一种重要病原体。猫感染FCV后,出现发热、口腔溃疡、鼻-结膜炎等临床症状,发病严重时会导致死亡。猫杯状病毒流行广泛,在世界多个国家均有流行。我国从猫、老虎、猎豹等多种动物体内分离到FCV。不同猫杯状病毒毒株间变异程度较大,抗原性有差异,现有疫苗并不能提供完全的保护效果。目前,猫杯状病毒疫苗主要为弱毒疫苗和灭活疫苗,随着FCV的广泛流行,不断出现新的变异毒株。因此,开展对FCV的相关研究对其防控具有重要的意义。本研究对采自吉林地区疑似猫传染性鼻结膜炎患猫鼻咽拭子进行处理后,在F81细胞上进行分离培养,开展分子生物学、形态学、免疫学等系统鉴定;将分离病毒及实验室保存的1株豹源猫杯状病毒在F81细胞上连续传至20代。每次细胞传代前,测定病毒的半数感染量(TCID50),然后以0.1MOI的感染复数接种F81细胞,记录病变时间,并绘制病毒的生长曲线;采用RT-PCR方法扩增FCV各代次(P1、P5、P10、P15、P20)的ORF2基因片段,进行基因序列的测定;利用DNASTAR、MEGA等软件将测序结果与Genbank上收录的FCV参考序列进行比对,分析其氨基酸变异位点,并绘制遗传进化树;应用Net NGlyc1.0、Yin OYang1.2、Prot Scale等在线软件预测ORF2基因编码蛋白的糖基化位点和疏水性。实验结果显示,猫鼻咽拭子接种F81细胞后,出现葡萄串样典型病变,经过分子生物学、形态学和免疫学鉴定,证实所分离毒株为猫杯状病毒,分别命名为CH-JL1株、CH-JL2株、CH-JL3株和CH-JL4株;细胞传代后,5株FCV滴度逐渐稳定,最终达到109.0TCID50/mL以上;生长曲线测定结果表明,FCV各毒株在细胞上的复制特点有差异,CH-JL3株和CH-SH株在16h左右达到最高的病毒滴度,CH-JL2株和CH-JL4株均在20h左右病毒滴度最高,而CH-JL1株病毒的滴度高峰在24h之后;ORF2基因序列比对分析结果表明,FCV细胞传代后的氨基酸变异位点包括CH-JL1株的P57S和G494R、CH-JL3株的S440L和N519D、CH-JL4株的V614I、CH-SH株的K448R;遗传进化分析表明CH-JL2株和CH-JL3株处于同一进化分支上,同源性为95.9%;CH-JL1株和国内FB-NJ-13株、CH-SH株和国内GD株分别在一个进化分支,CH-JL4株和国外F65株遗传关系较近。ORF2基因编码蛋白的糖基化位点和疏水性预测分析发现5株FCV疏水性相似,均存在多个O-糖基化位点。本研究从猫鼻咽拭子中成功分离出猫杯状病毒,通过细胞连续传代,获得了滴度高、稳定性好的猫杯状病毒株,为下一步FCV疫苗株的研发打下了基础。
【关键词】：猫杯状病毒 细胞传代 F81细胞 基因变异
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-18
• 1.1 猫杯状病毒的概述10-13
• 1.2 猫杯状病毒的流行病学13-14
• 1.3 猫杯状病毒感染的诊断14
• 1.4 猫杯状病毒感染的防控14-15
• 1.5 病毒的分离与鉴定研究进展15-16
• 1.6 研究目的和意义16-18
• 第二篇 研究内容18-45
• 第一章 猫杯状病毒的分离和鉴定18-29
• 1.1 材料18-20
• 1.2 方法20-24
• 1.3 结果24-27
• 1.4 讨论27-28
• 1.5 小结28-29
• 第二章 猫杯状病毒的细胞传代及ORF2基因变异分析29-45
• 2.1 材料29-31
• 2.2 方法31-34
• 2.3 结果34-41
• 2.4 讨论41-43
• 2.5 小结43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-53
• 附录53-62
• 作者简介62-63
• 致谢63

【参考文献】

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4 黄倩倩;刘家森;田进;孔德生;曲连东;;猫杯状病毒的分离鉴定及其对理化因素抵抗力的研究[J];中国兽医科学;2015年04期

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本文编号：1025314