青藏地区斑头雁（Anser indicus）携带病原的监测研究

发布时间：2017-10-15 19:53

  本文关键词：青藏地区斑头雁（Anser indicus）携带病原的监测研究

  更多相关文章： 禽流感病毒 H5N1 粪便细菌 分子特征 遗传进化分析 耐药性

【摘要】：青藏地区是重要的候鸟繁殖地和越冬地,每年约上万只候鸟在此停留。2005年5月,青海湖野鸟中暴发高致病性禽流感,导致上千只野鸟死亡,其中超过一半为斑头雁(Anser indicus),随后该病毒扩散至欧洲和非洲地区,且在接下来的几年中,该毒株在中亚迁徙路线的候鸟中被多次分离到,这使野鸟在禽流感传播中所起到的作用受到关注。除禽流感病毒外,斑头雁也可能携带病原细菌,对野生动物、家畜家禽以及人类的健康造成威胁。每年4~9月,有超过6000只斑头雁陆续迁徙至青海湖进行繁殖及育雏,频繁的个体间的接触可能会促进了病毒、细菌等病原在野鸟之间的水平传播。本研究于2013~2015年,采集青藏地区斑头雁组织器官及新鲜粪便累计1792份,首先采用RT-PCR试验进行禽流感病毒核酸的检测,然后对核酸检测为阳性的样品,采用SPF鸡胚进行病毒分离,最后对分离得到的禽流感病毒进行分子特征及遗传进化分析。同时,对2015年青海湖采集到的斑头雁粪便进行细菌的分离鉴定以及耐药性分析,探讨斑头雁粪便中携带细菌性病原的情况。主要研究结果如下:1.2013~2015斑头雁携带禽流感病毒检测与病毒的分离2013年、2014年、2015年分别在环青海湖湿地河口采集斑头雁粪便及组织样品124份、348份、860份,其中2015年在青海湖月牙湾采集死亡斑头雁幼鸟一只;2015年在西藏雅鲁藏布江流域采集斑头雁粪便460份。对样品进行禽流感病毒核酸检测,显示2013~2015年,青海湖斑头雁中禽流感病毒核酸的阳性检出率分别为0.72%(9/124)、5.7%(20/348)、18%(157/860);2015年,西藏雅鲁藏布江流域采集到的斑头雁粪便中,禽流感病毒核酸的阳性检出率是22%(101/460)。从2015年采集的死亡斑头雁幼鸟的肺部组织和3个斑头雁粪便样品中共分离到4株禽流感病毒H5N1,分别命名为A/bar-headed goose/Qinghai/F/2015(H5N1)、A/bar-headed goose/47/2015(H5N1)、A/bar-headed goose/Qinghai/70/2015(H5N1)、A/bar-headed goose/Qinghai/133/2015-(H5N1),简称QHL-F、QHL-47、QHL-70、QHL-133。2.禽流感病毒分子特征及遗传进化分析对2015年分离到的4株禽流感病毒进行全基因测序,并进行分子特征及遗传进化分析,结果表明,青海湖分离株QHL-F、QHL-47、QHL-70、QHL-133属于2.3.2.1c谱系,与2015年1月三门峡大天鹅疫情中分离到的毒株A/whooper swan/Henan/SMX1/2015(H5N1)各个基因片段均高度同源,且序列的一致性在99%~100%之间。对青海湖分离株进行遗传特征分析,发现其HA蛋白碱性裂解位点均含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的典型分子特征。HA蛋白138A、160A位点发生变异,突变用这种形式表示:S138A,表示有S突变为A,这可能会增强病毒结合哺乳动物受体的能力。NA茎部有20个氨基酸的缺失,这可能会增加病毒在哺乳动物中的致病力。此外,未发现其他与病毒致病性及耐药性相关的氨基酸位点发生变异。3.斑头雁粪便中细菌的分离鉴定从2015年采集的斑头雁粪便中挑选出30份进行细菌的分离鉴定。从30份斑头雁粪便中共分离到细菌123株,根据细菌在营养琼脂培养基中的形态特征以及革兰氏染色情况,将分离到的细菌分为10类,分别从每一类细菌中挑取一株细菌进行生理生化及分子生物学鉴定。结果显示这10株细菌分别为大肠埃希菌(Escherichia coli)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、枯草芽孢杆菌(Arthrobacter citreus)、柠檬节杆菌(Bacillus sublitis)、腐败希瓦氏菌(Shewanella pulrefaciens)、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。选取氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢他啶、氨曲南、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四环素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星药敏纸片,对分离菌株进行耐药性分析,发现水生拉恩菌、杀鲑气单胞菌和成团泛菌表现为多重耐药性;其他细菌对氨苄西林和四环素有一定的耐药性,对其余受试药物都有不同程度的敏感性。
【关键词】：禽流感病毒 H5N1 粪便细菌 分子特征 遗传进化分析 耐药性
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.9
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 第一章 前言15-30
• 1.1 禽流感概述15-23
• 1.1.1 禽流感定义15
• 1.1.2 禽流感病毒的分类和命名15-16
• 1.1.3 禽流感病毒粒子特点16
• 1.1.4 禽流感病毒基因及其编码蛋白16-17
• 1.1.5 禽流感病毒的分子致病机制17-18
• 1.1.6 禽流感病毒的耐药机制18
• 1.1.7 禽流感的流行与危害18-20
• 1.1.8 禽流感的宿主范围、致病性及决定因素20-22
• 1.1.9 野生鸟类感染禽流感情况22-23
• 1.2 野鸟中携带的细菌23-27
• 1.2.1 革兰氏阳性球菌23-24
• 1.2.2 革兰氏阳性杆菌24
• 1.2.3 肠杆菌科24-25
• 1.2.4 分枝杆菌科25
• 1.2.5 弯曲杆菌科25
• 1.2.6 螺旋体科25
• 1.2.7 巴斯德氏菌科25-26
• 1.2.8 弧菌科26
• 1.2.9 支原体26
• 1.2.10 衣原体26-27
• 1.2.11 立克次氏体及无形小体科27
• 1.3 斑头雁的重要分布与迁徙27-29
• 1.3.1 斑头雁迁徙路线的研究方法27-28
• 1.3.2 斑头雁的迁徙路线及其影响因素28
• 1.3.3 斑头雁在我国的重要分布地点和时间28-29
• 1.4 研究目的及意义29-30
• 第二章 2013-2015 年斑头雁携带禽流感病毒检测与病毒的分离30-42
• 2.1 实验材料与实验方法30-37
• 2.1.1 实验材料30-32
• 2.1.2 实验方法32-37
• 2.2 结果和讨论37-41
• 2.2.1 结果37-39
• 2.2.2 讨论39-41
• 2.3 小结41-42
• 第三章 禽流感病毒分子特征及遗传进化分析42-66
• 3.1 实验材料与实验方法42-48
• 3.1.1 实验材料42-43
• 3.1.2 实验方法43-48
• 3.2 结果与讨论48-65
• 3.2.1 结果48-62
• 3.2.2 讨论62-65
• 3.3 小结65-66
• 第四章 斑头雁粪便中细菌种类及耐药性分析66-77
• 4.1 实验材料与实验方法66-70
• 4.1.1 实验材料66-67
• 4.1.2 实验方法67-70
• 4.2 结果与讨论70-75
• 4.2.1 结果70-74
• 4.2.2 讨论74-75
• 4.3 小结75-77
• 参考文献77-92
• 在读期间学术研究92-93
• 致谢93-94

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