鸡XOD亚基的原核表达、定位及其在NIBV感染后的蛋白表达量分析

发布时间：2017-10-16 15:05

  本文关键词：鸡XOD亚基的原核表达、定位及其在NIBV感染后的蛋白表达量分析

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【摘要】：黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)是参与机体内嘌呤代谢的关键酶,研究发现XOD在机体内的病理过程中也起到了重要作用。本试验参照GenBank中收录的G.gallus XOD基因序列(D13221.1)设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增一段XOD亚基序列(987 bp),通过基因克隆,将目的基因插入到PMD-18-T载体上。确定正确插入后,将酶切后的目的基因连接至pET-32a(+)载体,构建鸡XOD原核表达载体pET-XOD,并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,诱导表达重组鸡XOD蛋白。通过镍柱亲和层析的方法纯化重组鸡XOD蛋白,以复性浓缩后的重组鸡XOD蛋白作为抗原制备抗体血清,使用间接ELISA和Western blot的方法分别确定抗体的效价和特异性。通过利用免疫组化和免疫荧光的方法,使用本试验中制备的多克隆抗体,定位鸡XOD在肝、肾组织中的分布。通过利用Western blot相对定量蛋白的方法,检测鸡在感染肾型传染性支气管炎(NIBV)后肾组织中XOD和Bcl-2蛋白表达量的变化。结果表明:鸡XOD原核表达系统构建成功,并分离纯化到了高浓度的重组鸡XOD蛋白(大小约54 KDa)。用该蛋白制备的多克隆抗体效价约1:102400,可特异性地检测鸡肝组织中的XOD。免疫组化和免疫荧光检测结果显示鸡XOD主要存在于肝、肾组织细胞胞质之中。同时,蛋白定量结果表明在鸡NIBV感染后会引起肾组织中XOD和Bcl-2的蛋白表达量的显著上升(P0.05)。本试验通过构建体外高效表达XOD蛋白的方法,获得了纯度较高的重组鸡XOD蛋白。并用表达的重组鸡XOD蛋白制备了多克隆抗体,且使用此抗体定位了XOD在鸡肝、肾组织中的分布及NIBV感染后的肾组织中XOD蛋白表达量分析,为进一步揭示鸡NIBV感染后的病理机制提供了理论依据。
【关键词】：黄嘌呤氧化酶 鸡 NIBV Western blot 免疫组化 免疫荧光
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1 黄嘌呤氧化酶13-16
• 1.1 XOD的结构13
• 1.2 XOD在机体的分布13
• 1.3 XOD的应用13-15
• 1.3.1 XOD的生理功能13-14
• 1.3.2 XOD的先天免疫作用14
• 1.3.3 检测SOD活力14
• 1.3.4 测定血清中无机磷14-15
• 1.3.5 提高利巴韦林的转化率15
• 1.3.6 鱼类新鲜度的测定15
• 1.4 XOD相关的研究进展15-16
• 1.4.1 XOD与疾病15
• 1.4.2 XOD抑制剂的开发15-16
• 1.4.3 XOD合成菌的选育16
• 1.4.4 XOD的纯化16
• 2 原核表达系统概述16-19
• 2.1 大肠杆菌表达载体的调控原件16-17
• 2.2 大肠杆菌表达载体的类型17-19
• 2.2.1 非融合表达载体17
• 2.2.2 融合表达载体17-18
• 2.2.3 分泌表达载体18
• 2.2.4 表面呈现表达载体18
• 2.2.5 带伴侣蛋白的表达载体18-19
• 2.3 外源目的蛋白的表达形式19
• 3 禽IB的研究进展19-21
• 3.1 IBV的分型19-20
• 3.1.1 NIBV感染后的临床症状19
• 3.1.2 NIBV感染后的病理变化19-20
• 3.2 IB的预防与治疗20-21
• 3.2.1 IB的预防20
• 3.2.2 IB的治疗20-21
• 4 本研究的目的和意义21
• 5 研究内容与试验流程21-23
• 5.1 研究内容21-22
• 5.2 试验流程22-23
• 第二章 鸡XOD的原核表达23-42
• 1 材料与方法23-26
• 1.1 主要试剂23-24
• 1.2 主要仪器设备24
• 1.3 试剂、培养基的制备24
• 1.4 琼脂糖凝胶电泳所需试剂的制备24-25
• 1.5 SDS-PAGE试剂配制25
• 1.6 纯化试剂配制25-26
• 1.7 蛋白透析复性液的配制26
• 1.7.1 透析袋处理液26
• 1.7.2 透析复性液26
• 2 实验方法26-32
• 2.1 鸡XOD的生物信息学分析26
• 2.1.1 鸡XOD信号肽位点的预测分析26
• 2.1.2 鸡XOD抗原肽端分析26
• 2.1.3 鸡XOD基因的稀有密码子分析26
• 2.2 克隆质粒PMD-XOD的构建26-29
• 2.2.1 引物的设计26-27
• 2.2.2 鸡肝组织RNA的提取27
• 2.2.3 cDNA的合成27
• 2.2.4 XOD基因的PCR扩增27
• 2.2.5 XOD基因产物的纯化27
• 2.2.6 XOD基因的克隆27-28
• 2.2.7 连接产物的转化28
• 2.2.8 克隆菌株的筛选和鉴定28-29
• 2.3 表达载体pET-XOD的构建29-30
• 2.3.1 原核表达载体和XOD基因的制备29
• 2.3.2 XOD基因与表达载体的连接29
• 2.3.3 连接产物的转化29
• 2.3.4 表达菌株的筛选和鉴定29-30
• 2.4 目的蛋白的诱导表达30
• 2.4.1 目的蛋白的诱导表达30
• 2.4.2 目的蛋白的大量表达30
• 2.4.3 目的蛋白表达形式的鉴定30
• 2.5 目的蛋白纯化、复性及浓缩30-31
• 2.5.1 蛋白纯化条件的优化30-31
• 2.5.2 目的蛋白透析复性及浓缩31
• 2.6 SDS-PAGE分析31-32
• 3 结果与分析32-40
• 3.1 鸡XOD的生物信息学分析结果32-33
• 3.1.1 鸡XOD信号肽端的预测分析结果32-33
• 3.1.2 鸡XOD抗原肽端分析33
• 3.1.3 鸡XOD基因的稀有密码子分析结果33
• 3.2 克隆载体PMD-XOD的构建33-34
• 3.2.1 XOD基因的扩增33
• 3.2.2 克隆载体PMD-XOD的筛选和鉴定33-34
• 3.3 表达质粒pET-XOD的构建34-37
• 3.3.1 原核表达载体及XOD基因的制备34-35
• 3.3.2 pET-XOD载体的筛选和鉴定35-37
• 3.4 重组蛋白的表达37-40
• 3.4.1 重组蛋白的IPTG诱导表达37
• 3.4.2 重组蛋白表达形式的鉴定37-38
• 3.4.3 包涵体的溶解鉴定38-39
• 3.4.4 咪唑浓度优化39
• 3.4.5 蛋白复性浓缩后的SDS-PAGE鉴定39-40
• 4 讨论40-42
• 4.1 XOD目的表达区域基因的获取40
• 4.2 表达系统的构建40-41
• 4.2.1 表达系统的选择40-41
• 4.2.2 表达载体的选择41
• 4.3 重组XOD蛋白的纯化41-42
• 第三章 鸡XOD多克隆抗体的制备42-50
• 1 材料与方法42-43
• 1.1 试验材料42
• 1.2 主要仪器42
• 1.3 ELISA试剂配制42-43
• 1.4 Western Blot试剂配制43
• 2 实验方法43-45
• 2.1 家兔免疫43-44
• 2.2 ELISA方法检测抗体的效价44-45
• 2.2.1 最佳抗原包被浓度及抗体稀释倍数的确定44
• 2.2.2 抗体效价的确定44-45
• 2.3 Western Blot分析45
• 2.3.1 鸡肝组织总蛋白的提取45
• 2.3.2 鸡肝组织蛋白的Western Blot检测45
• 3 结果与分析45-47
• 3.1 最佳抗原包被浓度及抗体稀释度的确定45-46
• 3.2 抗体效价的确定46-47
• 3.3 Western Blot检测鸡肝组织总蛋白中的XOD47
• 4 讨论47-50
• 4.1 重组鸡XOD蛋白多克隆抗体血清的制备47-48
• 4.2 间接ELISA方法测定抗体效价48
• 4.3 Western blot鉴定抗体特异性48-50
• 第四章 鸡XOD在肝、肾组织中的定位分析50-55
• 1 材料与方法50
• 1.1 试验材料50
• 1.2 主要仪器50
• 1.3 试剂的配制50
• 2 试验方法50-51
• 2.1 免疫组化检测50-51
• 2.2 免疫荧光检测51
• 3 结果与分析51-53
• 3.1 免疫组化检测XOD分布52-53
• 3.2 免疫荧光检测XOD分布53
• 4 讨论53-55
• 4.1 鸡肝肾组织中XOD的定位53-54
• 4.2 免疫组化和免疫荧光的优缺点54-55
• 第五章 鸡NIBV感染后肾XOD及BCL-2 的蛋白表达量分析55-61
• 1 材料与方法55-56
• 1.1 试验材料55
• 1.2 主要仪器55
• 1.3 试剂配制55-56
• 2 试验方法56-58
• 2.1 试验动物攻毒56
• 2.2 鸡肾组织采集56
• 2.3 鸡肾组织蛋白的提取56-57
• 2.4 鸡肾组织蛋白浓度的测定57-58
• 2.4.1 BSA标准品的稀释57
• 2.4.1 定量检测蛋白浓度57
• 2.4.2 Western Blot相对定量分析57-58
• 2.5 数据分析58
• 3 结果与分析58-59
• 3.1 临床症状和剖检情况58
• 3.2 肾组织总蛋白的浓度的测定58-59
• 3.3 XOD及Bcl-2 蛋白表达的相对定量59
• 4 讨论59-61
• 全文总结61-62
• 参考文献62-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的论文68

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