鹿源布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因的克隆与原核表达

发布时间：2017-10-16 18:06

  本文关键词：鹿源布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因的克隆与原核表达

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【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病,主要宿主是羊、牛和猪,呈世界范围流行,并且鹿场感染布鲁氏菌的现象逐渐增多。近几年来,布鲁氏菌病在中国的流行呈上升趋势,严重危害了畜牧业发展和人类健康。目前,对易感动物进行疫苗免疫和对患病动物进行扑杀是防控布鲁氏菌病的有效手段。所以,利用生物学手段研制出高效、安全的疫苗,并迅速对布鲁氏菌病进行准确诊断是预防布鲁氏菌病的关键。在布鲁氏菌众多具有抗原保护作用的外膜蛋白中,Omp31作为布鲁氏菌的免疫保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体,是基因工程疫苗的理想候选基因,也是用于布鲁氏菌临床诊断的首选基因和蛋白。此外,外膜蛋白Omp31是布鲁氏菌的毒力基因,高度保守,Omp31基因的缺失可降低布鲁氏菌的毒力,所以可以通过缺失Omp31基因来研制基因缺失疫苗。本研究从疑似感染布鲁氏菌的鹿病料中提取基因组DNA,经PCR扩增和TA克隆,构建克隆载体pMD18T-Omp31,经转化和提取质粒,以及BamH I和Xho I双酶切,将获得的Omp31基因亚克隆至pET28a原核表达载体,构建pET28a-Omp31原核表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21感受态,经IPTG诱导,使Omp31基因在大肠杆菌BL21感受态中表达,并经Western Blot确定该重组蛋白的反应原性。结果显示,本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Omp31,经IPTG诱导,其可在大肠杆菌BL21感受态中获得稳定表达,Omp31重组蛋白以包涵体形式存在,镍柱纯化的蛋白浓度较高,Western Blot试验显示其具有良好的反应原性。本研究成功表达和纯化的Omp31重组蛋白不仅浓度较高,也具有较好的反应原性,为进一步研制布鲁氏菌的亚单位疫苗、基因缺失疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定了基础。
【关键词】：布鲁氏菌 Omp31基因 原核表达 反应原性
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 1 前言11-18
• 1.1 布鲁氏菌病国内外的流行状况11-12
• 1.1.1 世界范围内的布鲁氏菌病疫情11
• 1.1.2 国内布鲁氏菌病的疫情11-12
• 1.2 布鲁氏菌病的病原学12-13
• 1.3 布鲁氏菌的感染过程及症状13-14
• 1.4 布鲁氏菌病疫苗的研究进展14-15
• 1.5 布鲁氏菌病的诊断方法15-16
• 1.6 关于外膜蛋白Omp31的研究进展16-17
• 1.7 研究的目的和意义17-18
• 2 布鲁氏菌Omp31基因的扩增及载体构建18-28
• 2.1 材料和方法18-20
• 2.1.1 材料18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 主要仪器设备18
• 2.1.4 溶液配制18-20
• 2.1.4.1 培养菌种所用溶液18-19
• 2.1.4.2 感受态细胞制备所用试剂19
• 2.1.4.3 琼脂糖凝胶所用试剂19-20
• 2.2 实验操作步骤20-25
• 2.2.1 pMD18T-Omp31克隆载体的构建20-23
• 2.2.1.1 引物设计20
• 2.2.1.2 细菌的培养20
• 2.2.1.3 菌落PCR扩增20
• 2.2.1.4 目的片段的回收20-21
• 2.2.1.5 回收目的片段与pMD18-T载体的连接21
• 2.2.1.6 感受态细胞的制备21-22
• 2.2.1.7 转化到DH5α感受态细胞22
• 2.2.1.8 菌落PCR22-23
• 2.2.2 pET28a-Omp31表达载体的构建23-25
• 2.2.2.1 质粒抽提23-24
• 2.2.2.2 酶切24
• 2.2.2.3 目的片段的回收24
• 2.2.2.4 连接24
• 2.2.2.5 转化24-25
• 2.2.2.6 PCR筛选、测序25
• 2.2.2.7 质粒提取25
• 2.3 结果25-28
• 2.3.1 PCR扩增结果25-26
• 2.3.2 pMD18T-Omp31克隆载体构建结果26
• 2.3.3 pMD18T-Omp31克隆载体双酶切结果26-27
• 2.3.4 pET28a-Omp31克隆载体构建结果27-28
• 3 布鲁氏菌Omp31蛋白原核表达及纯化28-35
• 3.1 材料和方法28-30
• 3.1.1 主要试剂28
• 3.1.2 仪器28
• 3.1.3 溶液配置28-30
• 3.1.3.1 SDS-PAGE试剂28-29
• 3.1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配置29
• 3.1.3.3 蛋白纯化试剂29-30
• 3.2 实验操作步骤30-32
• 3.2.1 蛋白诱导30-31
• 3.2.1.1 转化30
• 3.2.1.2 小量诱导30
• 3.2.1.3 大量诱导30-31
• 3.2.2 蛋白纯化31-32
• 3.2.2.1 蛋白的变性31-32
• 3.2.2.2 Ni柱纯化32
• 3.3 结果分析32-35
• 3.3.1 小量诱导结果32-33
• 3.3.2 超声及纯化结果33-35
• 4 Omp31蛋白的Western Blot鉴定35-39
• 4.1 材料和方法35-37
• 4.1.1 材料35
• 4.1.2 试剂35
• 4.1.3 主要仪器35
• 4.1.4 溶液配置35-36
• Western Blot所用试剂35-36
• 4.1.5 主要方法步骤36-37
• 4.1.5.1 用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度36-37
• 4.1.5.2 Western Blot验证蛋白活性37
• 4.2 结果分析37-39
• 4.2.1 BCA法蛋白浓度测定结果37-38
• 4.2.2 Western Blot结果38-39
• 5 讨论39-41
• 6 结论41-42
• 参考文献42-45
• 致谢45-46
• 附录46

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本文编号：1044115