猫杯状病毒VP1抗原性分析及间接ELISA诊断方法的建立

发布时间：2017-10-17 06:14

  本文关键词：猫杯状病毒VP1抗原性分析及间接ELISA诊断方法的建立

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【摘要】：猫杯状病毒(Feline Calicivirus,FCV)是猫和其它猫科动物的重要病原体,属于杯状病毒科水疮性病毒属成员,其核酸为单股正链RNA分子,病毒无囊膜,只有一个血清型。FCV多感染一岁以下的幼猫,通常导致急性口腔和上呼吸道传染病,主要症状为口腔溃疡、鼻炎、结膜炎、上呼吸道感染、跛行等,高致病性毒株甚至能引起猫的全身性感染,并导致死亡。目前,FCV的诊断方法主要有RT-PCR、免疫荧光技术、中和试验、琼脂扩散试验、夹心ELISA和间接ELISA,但是目前国内尚没有商品化的ELISA试剂盒。间接ELISA诊断方法能为FCV感染提供准确诊断,且具有简单、快速、灵敏性高等优势,对该病的流行病学调查、监测以及防控具有重要意义。VP1蛋白是FCV的主要结构蛋白,分为A、B、C、D、E、F六个区域,含有多个抗原表位。为了明确FCV VP1蛋白的抗原性,获得理想的重组抗原。本研究利用分子生物学软件Protean对A、B、C、D、E、F六个区域进行抗原表位预测,并用Megalign软件分析其保守性;设计引物,RT-PCR扩增目的基因,进行了原核表达和Western Blot及血清学抗原性分析。Protean软件分析发现VP1基因的B区(125aa-397aa)、E区(426aa-524aa)、F区(524aa-668aa)均具有较高的抗原性,而Megalign软件分析表明氨基酸保守性分别为B区(90.2%-100%)、E区(67.7%-100%)、F区(89%-100%),均相对保守。Western Blot证明VP1-B、VP1-E、VP1-F蛋白具有较好反应原性,进一步血清学抗原性分析证明VP1-F蛋白具有良好的抗原性。在确定了VP1-F蛋白具有良好抗原性的基础上,以此为包被抗原建立了FCV间接ELISA诊断方法。选择优势抗原VP1-F作为包被蛋白抗原,进行了反应条件优化,并确立了阴阳性临界值,对建立的间接ELISA方法进行特异性、重复性、敏感性评价,与血清中和试验和间接免疫荧光试验作比对,并对临床血清样品进行检测。结果表明,抗原VP1-F的最佳包被浓度为2μg/mL,最佳包被时间为37℃2h;待检血清最佳稀释度为1:100,最佳作用时间为37℃1h;最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭时间为37℃1h;二抗最佳稀释度为1:5000,最佳作用时间为37℃45min,底物最佳作用时间为4min。确立了阴阳性临界值0.352。建立的间接ELISA诊断方法对猫疱疹病毒阳性血清、猫细小病毒阳性血清、猫传染性腹膜炎病毒Ⅰ型阳性血清、猫传染性腹膜炎病毒Ⅱ型阳性血清均无交叉反应,特异性良好。用同一批次和不同批次包被的酶标板检测质控血清,变异系数均小于10%,重复性良好。FCV的质控阳性血清稀释至1:3200仍显示为阳性,敏感性良好。与血清中和试验符合率为95%,与间接免疫荧光试验符合率为100%。用建立的间接ELISA诊断方法检测从哈尔滨花鸟鱼宠物市场采集到的60份猫血清样品,抗体阳性率为88.3%。综上所述,本研究对FCV VP1蛋白各区进行抗原表位预测和保守性分析。利用原核表达系统成功表达重组蛋白VP1-A、VP1-B、VP1-CD、VP1-E、VP1-F,对其进行Western Blot和血清学抗原性分析,获得优势抗原VP1-F蛋白,以VP1-F作为包被蛋白建立了具有良好的特异性、重复性、敏感性的间接ELISA诊断方法,为FCV的诊断和防控奠定了基础。
【关键词】：猫杯状病毒 VP1截短蛋白 抗原性分析 间接ELISA
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 符号说明10-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.1 研究进展11-12
• 1.2 FCV生物学特性12-13
• 1.2.1 病原学12
• 1.2.2 病毒基因组结构及其编码产物12-13
• 1.2.3 理化特性13
• 1.2.4 培养特性13
• 1.3 FCV流行病学13-14
• 1.4 诊断及检测方法14-16
• 1.4.1 ELISA14-15
• 1.4.2 RT-PCR及荧光定量PCR15
• 1.4.3 其它检测方法15-16
• 1.5 治疗及预防16-17
• 1.6 目的意义17-19
• 第二章 猫杯状病毒VP1衣壳蛋白的截短表达及抗原性分析19-39
• 2.1 材料与试剂19-20
• 2.1.1 材料19
• 2.1.2 试剂19
• 2.1.3 主要实验仪器19-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 FCV VP1抗原表位预测及保守性分析20
• 2.2.2 引物设计与合成20-21
• 2.2.3 FCV VP1原核表达重组质粒的构建21-26
• 2.2.4 目的蛋白的诱导表达及诱导条件的优化26-27
• 2.2.5 原核表达产物的检测、纯化及鉴定27-30
• 2.2.6 VP1截短蛋白的血清学抗原性分析30
• 2.3 结果30-36
• 2.3.1 FCV VP1抗原表位预测及保守性分析结果30-31
• 2.3.2 FCV VP1原核表达重组质粒的构建与鉴定31-32
• 2.3.3 目的蛋白的诱导表达、鉴定及纯化结果32-35
• 2.3.4 VP1截短蛋白的血清学抗原性分析结果35-36
• 2.4 讨论36-39
• 第三章 猫杯状病毒重组间接ELISA诊断方法的建立39-51
• 3.1 材料39
• 3.1.1 血清39
• 3.1.2 主要试剂、仪器39
• 3.2 方法39-43
• 3.2.1 间接ELISA方法操作步骤39
• 3.2.2 间接ELISA检测条件的优化39-41
• 3.2.3 阴阳性临界值的确立41
• 3.2.4 ELISA效果评价分析41-43
• 3.2.5 临床血清样品的检测43
• 3.3 结果43-49
• 3.3.1 间接ELISA检测条件的优化43-46
• 3.3.2 阴阳性临界值的确立46-47
• 3.3.3 间接ELISA效果评价分析47-49
• 3.3.4 临床血清样品的检测49
• 3.4 讨论49-51
• 第四章 结论51-53
• 参考文献53-57
• 致谢57-59
• 附录59-63
• 个人简历63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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3 陈小庆;范胜涛;姜雪;赵艳丽;刘秋艳;应瑛;高玉伟;胡桂学;;临床健康宠物猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列分析[J];中国兽医杂志;2015年03期

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5 王，

本文编号：1047230