绵羊MBL基因真核表达载体构建及抗病相关miRNA的筛选

发布时间：2017-10-17 10:47

  本文关键词：绵羊MBL基因真核表达载体构建及抗病相关miRNA的筛选

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【摘要】：绵羊支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia,MP)是以咳嗽、喘气,渐进性消瘦及慢性增生性间质性肺炎为特征的绵羊慢性呼吸道传染病,致病机制比较复杂,临床诊断和防治比较困难。甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)作为天然免疫系统的一员,直接介导或通过凝集素途径激活补体,在机体天然免疫防御、免疫监视中发挥重要作用。目的:分析MBL蛋白在肺炎支原体感染引起的天然免疫中发挥的作用以及MBL蛋白在个体感染中的治疗效果,验证MBL蛋白与绵羊支原体肺炎的抗性关系。方法:(1)采集健康绵羊的肝脏,提取RNA,逆转录得到c DNA,设计引物扩增MBL编码区序列。经Eco RI和Hind III双酶切后,MBL目的基因和真核表达载体p TT5连接,构建绵羊MBL基因真核表达重组质粒p TT5-MBL,转染进CHO细胞和293细胞表达并分离纯化重组MBL蛋白。依据血清MBL分离纯化方法分离纯化绵羊血浆来源MBL蛋白。通过气管注射方法人工感染绵羊肺炎支原体,人工感染后每日观察其临床症状,人工感染14d时分别静脉注射重组MBL蛋白和血浆来源MBL蛋白,观察其临床症状,蛋白注射四周后宰杀。(2)在蛋白治疗-1d、7d、14d、21d、28d采集新鲜血液和血清,用ELISA方法和荧光定量PCR分析血清中MBL、TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3、IL-2、IL-4的浓度变化和表达水平。(3)蛋白注射四周后对抗病组和易感组患病绵羊屠宰取样,采集肝脏组织,放入液氮储存,送生物公司进行mi RNA Hi Seq高通量测序,并对测序结果进行生物信息学分析,筛选差异mi RNA。结果:(1)成功构建了绵羊MBL基因真核表达载体p TT5-MBL,表达并纯化出有活性的重组MBL。成功分离纯化出有活性的血浆来源MBL蛋白。人工感染组绵羊在感染后均出现了咳嗽、食欲减退、流鼻涕、腹泻等支原体症状。绵羊肺炎支原体回收培养,多项支原体生化鉴定和支原体PCR鉴定结果表明人工感染组绵羊均成功感染了绵羊肺炎支原体,证明人工感染成功。MBL蛋白注射后,注射蛋白后均出现了不同程度的体温下降,食欲恢复,与实验对照组相比,注射蛋白的两组剖检的眼观变化和切片的病理变化可见症状有轻微的减轻。(2)蛋白注射后,血清中的IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C3均在短期内有不同程度的升高,在蛋白注射14d后又逐渐降低,并且在不同时期均高于实验对照组。血清中C1表现为先降后升。说明注射蛋白后机体的细胞免疫和体液免疫功能均有所增强。注射MBL蛋白后患病机体MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3表达水平均有不同程度的升高,随后逐渐降低,说明随着病程的发展,炎症有所舒缓。(3)筛选出多多个免疫相关的mi RNA和信号通路。结论:(1)建立了绵羊MBL基因真核表达载体的构建方法。(2)MBL蛋白免疫治疗能短期内减轻绵羊支原体肺炎的临床症状和病理变化,增强机体的细胞免疫和体液免疫,提高机体的抗病能力,改善炎症状况。(3)利用高通量测序技术筛选出多个免疫相关的mi RNA和信号通路。
【关键词】：真核表达载体 绵羊支原体肺炎 甘露糖结合凝集素 免疫因子 荧光定量PCR
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.26
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 主要缩略词12-13
• 前言13-15
• 1 研究目的和意义13
• 2 论文理论依据13-14
• 3 论文总体研究思路14-15
• 第一章 文献综述15-25
• 1.1 绵羊支原体肺炎的研究进展15-17
• 1.1.0 病原学研究15
• 1.1.1 绵羊肺炎支原体的分类15
• 1.1.2 绵羊支原体的培养特性和生化特征15-16
• 1.1.3 流行病学研究16
• 1.1.4 致病机制的研究16-17
• 1.2 MBL研究进展17-20
• 1.2.1 绵羊MBL的基本结构17-18
• 1.2.2 绵羊MBL的功能概况18-19
• 1.2.3 MBL与感染性疾病的相关性19
• 1.2.4 MBL免疫治疗现状19-20
• 1.2.5 MBL基因与绵羊支原体肺炎的相关性20
• 1.3 相关细胞因子的研究进展20-22
• 1.3.1 IL-2 的研究进展20-21
• 1.3.2 IL-4 的研究进展21
• 1.3.3 IFN的研究进展21
• 1.3.4 TNF的研究进展21-22
• 1.3.5 C1和C3的研究进展22
• 1.4 ELISA的研究进展22-23
• 1.5 荧光定量PCR的研究进展23
• 1.6 miRNA的研究进展23-25
• 第二章 绵羊MBL基因真核表达载体的构建及MBL蛋白对患病绵羊的免疫治疗25-40
• 1 材料与方法25-29
• 1.1 主要试剂和仪器25
• 1.2 试验动物25
• 1.3 引物设计与PCR扩增25-26
• 1.4 pUC57-MBL载体构建26
• 1.5 pTT5-MBL真核表达载体的构建26
• 1.6 细胞培养26
• 1.7 细胞转染26
• 1.8 RT-PCR分析外源基因的表达26
• 1.9 重组蛋白的纯化26-27
• 1.10 SDS-PAGE和Western-blot检测27
• 1.11 酶联免疫吸附试验(ELISA)27
• 1.12 配体结合试验27
• 1.13 人工感染试验27
• 1.14 支原体分离鉴定27-28
• 1.15 绵羊肺炎支原体的PCR检测28
• 1.16 血浆来源MBL蛋白的提取及活性检测28-29
• 1.17 治疗试验29
• 2 结果29-38
• 2.1 真核表达载体的构建29-31
• 2.2 CHO-MBL和 293-MBL细胞的筛选与克隆化培养31
• 2.3 CHO-MBL细胞 293-MBL细胞内目的基因mRNA的表达31
• 2.4 重组MBL蛋白的SDS-PAGE和Western-blot检测31-33
• 2.5 血浆来源MBL蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果33-34
• 2.6 ELISA结果34
• 2.7 绵羊支原体理化鉴定34
• 2.8 绵羊肺炎支原体的PCR检测34-35
• 2.9 临床表现和剖检变化35-36
• 2.10 病理变化36-38
• 3 讨论38-39
• 4 结论39-40
• 第三章 ELISA方法和荧光定量PCR检测MBL蛋白对绵羊肺炎支原体免疫调节作用40-68
• 1 材料与方法40-45
• 1.1 试验动物40
• 1.2 主要试剂和仪器40-41
• 1.3 试验方法41-45
• 2 结果与分析45-64
• 2.1 MBL和各细胞因子标准曲线图45-47
• 2.2 MBL血清水平ELISA检测结果47-49
• 2.3 血清中IFN-γ、TNF-α、补体C1、C3、IL-2、IL-4 ELISA检测结果49-55
• 2.4 样品总RNA质量检测55
• 2.5 各引物PCR扩增结果55-57
• 2.6 荧光定量PCR结果57-64
• 3 讨论64-67
• 4 结论67-68
• 第四章 高通量测序技术分析患病绵羊的差异microRNAs68-84
• 1 材料与方法68-71
• 1.1 试验动物68
• 1.2 样品采集68
• 1.3 总RNA提取及鉴定68
• 1.4 序列的初步分析68-69
• 1.5 生物信息学分析69
• 1.6 新miRNA预测69
• 1.7 已知miRNA差异分析69
• 1.8 荧光定量qRT-PCR验证69-71
• 1.9 靶基因预测71
• 1.10 靶基因的GO富集和KEGG通路分析71
• 2 结果与分析71-82
• 2.1 总RNA提取结果71-72
• 2.2 Solexa测序结果72-73
• 2.3 新miRNA预测73-74
• 2.4 差异表达miRNA分析74-76
• 2.5 荧光定量验证76-77
• 2.6 靶基因预测77-78
• 2.7 靶基因GO富集分析与KEGG分析78-81
• 2.8 miR-432组织表达谱分析81-82
• 3 讨论82-84
• 全文总结84
• 创新点84-85
• 参考文献85-91
• 附录：实验试剂配制91-93
• 致谢93-94
• 作者 简介94-95
• 导师评阅表95

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本文编号：1048428