羊种布鲁氏菌hfq突变株毒力及其免疫保护作用研究

发布时间：2017-10-17 13:12

  本文关键词：羊种布鲁氏菌hfq突变株毒力及其免疫保护作用研究

  更多相关文章： 布病 hfq 毒力相关因子 宿主免疫反应 免疫保护作用

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是一种可累及全身多个器官与系统,有潜在致命危险的动物源性传染病,给全球经济与人类健康带来了巨大威胁。布鲁氏菌是兼性胞内寄生菌,无质粒与外毒素,在宿主细胞内有顽强的生存与繁殖能力。人与动物感染后主要呈现流产、不孕、空怀、睾丸炎、关节炎及心内膜炎等临床症状。细菌RNA分子伴侣蛋白Hfq (host factor for RNA phage Qβ replicase)是细菌重要的转录后调控因子。研究发现Hfq不仅影响病原体在各种压力条件下的生存与繁殖能力,还调控大量与毒力相关靶基因的转录。为进一步明确Hfq与布鲁氏菌的胞内生存能力、毒力之间的关系和缺失hfq后对布鲁氏菌免疫保护作用的影响,进行了以下研究：羊种布鲁氏菌缺失hfq后对其毒力影响的研究,主要包含羊种布鲁氏菌野生株(16M)、羊种布鲁氏菌hfq突变株(16M△hfq)及羊种布鲁氏菌hfq互补株(16M△hfq-C) RAW264.7细胞侵染试验、BALB/c小鼠毒力试验与小鼠感染过程中布鲁氏菌毒力相关基因omp25, omp31, vjbR, htrA, gntR, dnaK转录情况分析试验。结果显示：与16M相比,16M△hfq胞内生存能力与毒力都显著减弱,hfq在感染RAW264.7细胞中,早期转录水平高,而在感染小鼠体内,中后期转录水平高。在小鼠感染过程中,毒力相关基因omp25, omp31, vjbR, htrA, gntR, dnaK在16M△hfq中大部分时间点转录下调,在16M△hfq-C中,转录得到恢复,提示在感染过程中Hfq对这些毒力相关基因主要起正向调控作用。为研究Hfq对布鲁氏菌免疫保护作用的影响,进行了16M△hfq免疫保护作用评价试验。用16MAhfq感染BALB/c小鼠,PBS做对照,第45d对两组小鼠进行16M攻毒试验,攻毒后第14d与第28d脱颈处死小鼠,无菌取脾后对脾脏内CFU计数,初步评价其免疫保护作用。此外,通过BALB/c小鼠毒力试验与攻毒试验,获得小鼠脾脏cDNA样本和小鼠血清样本,采用qPCR法与ELISA法监测感染小鼠不同时间点细胞因子的变化。同时,采用ELISA法监测小鼠血清IgG水平。结果显示：从攻毒后脾脏CFU计数结果发现,与PBS组相比,16M△hfq在第14d提供了显著的免疫保护作用,差异显著,在第28d,16M△hfq组小鼠脾脏内布鲁氏菌已完全被清除。从小鼠细胞因子与IgG水平监测结果可知,qPCR法与ELISA法监测到小鼠血清中细胞因子水平结果趋势匹配。小鼠感染过程中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4,与16M组相比大部分时间点均显著下降,攻毒后4个细胞因子水平不同程度增高或降低,差异显著(P0.05)。第7d,16MAhfq组血清就能检测出抗体,然后持续上升,第45d达到最高OD450nm=0.57,攻毒后小鼠血清中抗体再次升高,攻毒后第28d,抗体水平达到OD450nm=0.79,各个时间点与PBS组相比,差异显著(P0.05)。保护性评价试验结果说明16M△hfq使宿主产生了特异性免疫反应,具有良好的免疫保护作用。
【关键词】：布病 hfq 毒力相关因子 宿主免疫反应 免疫保护作用
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文缩略词表10-14
• 第一章 文献综述14-31
• 1 布鲁氏菌概况14-24
• 1.1 布病的病原学特征及流行现状14-15
• 1.2 布鲁氏菌致病机理15-17
• 1.3 布鲁氏菌重要毒力相关因子17-20
• 1.3.1 布鲁氏菌外膜蛋白Omp25、Omp3118
• 1.3.2 密度感应系统调控子VjbR、转录调控因子GntR18-19
• 1.3.3 应激反应蛋白DnaK、HtrA19-20
• 1.4 布鲁氏菌引起宿主免疫机制的研究概况20-22
• 1.5 布鲁氏菌疫苗概况22-24
• 2 Hfq在细菌中的研究进展24-30
• 2.1 Hfq的结构特征25
• 2.2 Hfq的主要功能25-29
• 2.2.1 Hfq参与细菌多种生理代谢过程25-26
• 2.2.2 Hfq影响细菌毒力及分泌系统26-28
• 2.2.3 Hfq调控细菌大量基因28-29
• 2.3 Hfq在布鲁氏菌中的研究现状29-30
• 3 本研究的目的与意义30-31
• 第二章 Hfq对布鲁氏菌毒力影响的研究31-44
• 1 试验材料31-34
• 1.1 菌株与质粒31
• 1.2 细胞系与试验动物31-32
• 1.3 主要试剂32-33
• 1.4 主要仪器33-34
• 1.5 引物34
• 2 方法34-37
• 2.1 16M、16M△hfq、16M△hfq-C细胞侵染试验34-35
• 2.2 16M、16M△hfq、16M△hfq-C小鼠毒力试验35
• 2.3 hfq体内体外转录水平35-36
• 2.3.1 总RNA提取35-36
• 2.3.2 Dnasel处理36
• 2.3.3 cDNA合成36
• 2.3.4 PCR扩增36
• 2.4 毒力相关基因转录水平36-37
• 3 结果37-41
• 3.1 16M、16M△hfq、16M△hfq-C细胞侵染与小鼠毒力试验37-38
• 3.2 hfq体内外转录水平38
• 3.3 毒力相关基因转录水平38-41
• 4 讨论41-44
• 4.1 Hfq调控胞内生存能力与毒力41-42
• 4.2 Hfq调控大量毒力相关因子42-44
• 第三章 羊种布鲁氏菌hfq突变株免疫保护作用研究44-53
• 1 试验材料44-45
• 1.1 菌株与质粒44
• 1.2 细胞系与试验动物44
• 1.3 主要试剂44
• 1.4 主要仪器44-45
• 1.5 引物45
• 2 试验方法45-46
• 2.1 小鼠攻毒试验45
• 2.2 细胞因子水平测定45-46
• 2.3 血清IgG水平测定46
• 3 结果46-51
• 3.1 小鼠攻毒实验46-47
• 3.2 细胞因子水平测定47-50
• 3.2.1 感染小鼠细胞因子转录水平及分泌水平47-49
• 3.2.2 攻毒小鼠细胞因子转录水平及分泌水平49-50
• 3.3 血清IgG水平测定50-51
• 4 讨论51-53
• 结论与创新点53-54
• 1 结论53
• 2 创新点53-54
• 参考文献54-65
• 致谢65-67
• 攻读学位期间发表的学术论文目录67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：1049015