食品和饲料中动物源性成分PCR-层析试纸条快速检测方法及应用

发布时间：2017-10-18 01:19

  本文关键词：食品和饲料中动物源性成分PCR-层析试纸条快速检测方法及应用

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【摘要】：本研究建立了一种食品和饲料中动物源性成分PCR-层析试纸条快速检测方法,首先提取动物源性成分DNA,然后针对物种特异性DNA序列,设计引物,并对引物进行标记,两条引物的5′端分别标记异硫氰酸荧光素(FITC)和生物素(biotin),最后利用层析试纸条对结果进行判读。通过将PCR与通用免疫金标层析试纸条结合,实现了对食品和饲料中动物源性成分的简便、快捷、低成本、可视化的检测。1.引物的特异性:以驴肉和鸽子肉为阳性样品,其他动物样品和植物样品为阴性样品,使用标记过的驴和鸽子引物对其进行扩增,使用本研究建立方法进行检测。结果表明,本研究所设计的引物具有很高的特异性,能对驴和鸽子成分样品进行有效扩增。2.绝对灵敏度:将驴和鸽子DNA 5倍倍比稀释,使其浓度分别为100ng/μL,20 ng/μL,4 ng/μL,0.8 ng/μL,0.16 ng/μL,0.032 ng/μL,0.0064 ng/μL,0.0013 ng/μL,0.0003 ng/μL,0.0001 ng/μL and 0.00002 ng/μL,使用本研究建立方法进行检测。结果表明,本方法绝对灵敏度达到0.0013 ng/μL。3.实际灵敏度:分别以驴肉、鸽子肉为阳性样品,以牛肉模拟掺假样品,将驴肉、鸽子肉与牛肉切片,60℃烘干,研磨成粉末,过18目筛筛取粉末,制备驴肉和牛肉、鸽子肉和牛肉的混合模拟样品,以驴肉(鸽子肉)肉粉的质量百分比(W/W)为100%,50%,25%,10%,5%,1%,0.1%,0.01%,0.001%比例混匀,提取基因组DNA,DNA浓度调至5 ng/μL,使用本研究建立方法进行检测。结果表明,最低检测限可达0.01%,证明了本方法对于混合样品检测的高灵敏度。4.加工处理样品的实际灵敏度:将驴肉和牛肉、鸽子肉和牛肉混合样品分别用100℃高温2 h,油煎5 min。结果表明,经高温和油煎两种方式加工处理后,最低检测限降低为0.1%(w/w)。5.稳定性:将未处理的0.01%驴肉和牛肉、鸽子肉和牛肉的混合样品及高温和油煎2种加工处理的0.1%驴肉和牛肉、鸽子肉和牛肉的混合样品,重复20次进行最低检测限稳定性检测。结果表明,20次试纸条检测检测线均变红,结果均为阳性,即最低检测限的稳定性良好,检出率为100%。
【关键词】：动物源性成分 PCR-层析试纸条 快速检测
【学位授予单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS207.3;S816.17
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 研究背景9-10
• 1.2 动物源性成分检测技术10-11
• 1.2.1 PCR-技术10
• 1.2.2 多重PCR技术10
• 1.2.3 基因芯片技术10-11
• 1.2.4 分子指纹技术11
• 1.2.5 免疫分析技术11
• 1.2.6 质谱技术11
• 1.3 PCR-层析试纸条技术11-16
• 1.3.1 引物设计原则11-12
• 1.3.2 驴引物设计12-13
• 1.3.3 鸽子引物设计13
• 1.3.4 PCR-层析试纸条结构13
• 1.3.5 胶体金的性质特点13-14
• 1.3.6 胶体金颗粒与蛋白作用方式14
• 1.3.7 PCR-层析试纸条检测原理14-15
• 1.3.8 PCR-层析试纸条的制备15
• 1.3.9 PCR-层析试纸条的优点15-16
• 1.4 研究目的和意义16-17
• 1.4.1 研究目的16
• 1.4.2 研究意义16-17
• 第二章 材料与方法17-23
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 实验样品17
• 2.1.2 主要仪器17-18
• 2.1.3 主要试剂和材18-19
• 2.2 实验方法19-21
• 2.2.1 样品DNA提取19-20
• 2.2.2 PCR扩增20
• 2.2.3 引物特异性试验20
• 2.2.4 绝对灵敏度试验20-21
• 2.2.5 实际灵敏度试验21
• 2.2.6 加工处理样品实际灵敏度试验21
• 2.2.7 最低检出限稳定性试验21
• 2.3 结果判读21-23
• 第三章 结果与分析23-33
• 3.1 引物特异性试验23-25
• 3.2 灵敏度试验25-30
• 3.2.1 绝对灵敏度试验25-26
• 3.2.2 实际灵敏度试验26-28
• 3.2.3 加工处理样品灵敏度试验28-30
• 3.3 最低检出限稳定性试验30-33
• 第四章 初步应用33-43
• 4.1 试验材料33-34
• 4.1.1 样品采集33-34
• 4.1.2 主要仪器和试剂材料34
• 4.2 试验方法34-43
• 4.2.1 样品DNA提取和PCR扩增34
• 4.2.2 特异性试验34-35
• 4.2.3 稳定性试验35-43
• 第五章 结论43-44
• 参考文献44-47
• 致谢47

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本文编号：1052127