南方黄牛生长发育及其垂体组织转录组分析

发布时间：2017-10-18 08:47

  本文关键词：南方黄牛生长发育及其垂体组织转录组分析

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【摘要】：本研究在测定分析南方黄牛体重、体尺等生长性状及血浆中生长发育类激素水平的基础上,运用转录组测序和生物信息学分析技术筛选差异表达基因,最后进行实时荧光定量PCR验证,旨在进一步发掘南方黄牛生长发育关键基因及探索其调控机制。选取1周岁的云南文山牛、云岭牛(BMY牛)、西门塔尔牛各5头,按常规育肥方法进行饲养,日粮按精粗比(DM)65%：35%搭配,日采食量以牛只2.2%体重提供(DM),在相同的饲养环境条件下进行6个月的育肥试验。在育肥期间测定体重、体尺,并利用Elisa法测定血浆中生长发育类激素水平。屠宰后采集每头牛的垂体组织,利用RNA-seq高通量测序技术对试验牛垂体组织进行深度转录组测序,利用Q-PCR技术对转录组结果进行验证分析。主要结果如下：1.研究发现3个品种肉牛同龄体重大小顺序为：西门塔尔牛云岭牛文山牛,且每个月龄西门塔尔牛和云岭牛体重都极显著大于文山牛(P0.01)。1.5周岁时,文山牛体高、体长、胸围、管围等体尺显著小于西门塔尔牛及云岭牛(P0.05)；文山牛血浆中生长激素(GH)、甲状腺激素(T4)、甲状腺激素(T3)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素(INS)及促甲状腺激素(TSH)水平显著低于云岭牛(P0.05),其中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、生长激素(GH)及甲状腺激素(T3)水平也显著低于西门塔尔牛(P0.05)。2.对3个品种肉牛垂体组织进行转录组测序分析。以西门塔尔牛为对照,文山牛垂体组织中共检测到1733个差异表达基因,其中944个基因下调表达,789个基因上调表达,这些基因被注释到3779条GO term中；云岭牛垂体组织中共检测到1275个差异表达基因,其中521个基因上调表达,754个基因下调表达,这些基因被注释到3214条GO term中。以云岭牛对照,文山牛垂体组织中共检测到1789个差异表达基因,其中817个基因下调表达,972个基因上调表达,这些基因被注释到4129条GO term中(FC2,P0.05)。3.通过转录组KEGG富集分析,共筛选到生长发育相关通路25条,主要包括HIPPO信号通路(Hippo signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、 MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、RAP1信号通路(Rap 1 signaling pathway)、 Ras信号通路(Ras signaling pathway)、蛋白质在内质网加工(Protein processing inendoplasmic reticulum)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、神经营养因子信号转导通路(Neurotrophin signaling pathway)、细胞周期(Cell cycle)、FOXO信号通路(Foxo signaling pathway)、干细胞多能性信号通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)和神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)等。这些通路的变化可能跟南方黄牛的生长发育密切相关,例如神经活性配体-受体相互作用通路中富集的促甲状腺激素释放激素基因(TRH)在文山牛垂体组织处于下调状态,与之相反,TRH基因在西门塔尔牛和云岭牛垂体组织处于上调状态,这可能刺激了促甲状腺激素释放激素在西门塔尔牛和云岭牛中的表达,进而促进西门塔尔牛和云岭牛生长发育。再如,神经活性配体-受体相互作用通路中富集的生长抑素受体基因(SSTR5)在文山牛垂体组织处于上调状态,在西门塔尔牛和云岭牛垂体组织处于下调状态,这可能刺激了生长抑素受体在文山牛体内的表达,从而使生长抑素作用增强,进而抑制生长激素、促甲状腺激素的作用,导致文山牛体型较小,生长发育慢。4.将筛选到的与生长发育相关功能基因进行共表达网络分析,共发现35个枢纽基因,主要包括BMPR1B、TGFB2、BDNF、FIGF、CCNB1、CNTFR、CDKN2B、SSTR2、NGFR、 PDGFC、JAG2、TNFRSF11B、PRLR、MAPK12、SSTR5、CDK6、FGF20、GAS1、GHRHR、 TSHR、CKB、BMP6、CDKL5等。5.挑选8个显著差异表达的基因(GHRHR、JAG1、LRG1、FAM92B、LOC404103、CRYM、 BDNF、SLC2A4),利用Q-PCR技术对其进行定量分析,结果发现3个品种牛垂体组织的Q-PCR与转录组结果一致。本研究发现,胰岛素样生长因子、生长激素、甲状腺激素和促甲状腺激素及其功能相关差异表达基因(TTR、TSHR、TRH、SSTR5、SSTR2、IGFBP4、IGFBP5等)与南方黄牛生长发育密切相关；上述基因,同时与HIPPO信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、神经营养因子信号转导通路、细胞周期信号通路等多条生长发育相关信号通路中富集的REC8、BDNF、BMPR1B、MAP2K7、NGFR、TGFB2、BMP7、CDC20和FGF1等基因,可作为南方黄牛生长发育研究候选基因群。
【关键词】：南方黄牛 生长发育 生长发育类激素 垂体组织 转录组测序
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.81
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符号说明9-10
• 第一章 文献综述10-15
• 1 我国肉牛产业状况10
• 2 我国南方黄牛遗传资源特点10-11
• 3 制约生长发育相关激素简述11-12
• 4 转录组及转录组技术简述12-14
• 4.1 转录组研究的重要意义12-13
• 4.2 转录组测序平台13
• 4.3 转录组技术在动物上的应用13-14
• 5 本研究目的及意义14-15
• 第二章 南方黄牛生长发育分析15-25
• 1 南方黄牛体重及体尺性状分析15-19
• 1.1 试验材料15
• 1.2 饲养管理15
• 1.3 南方黄牛体重及体尺测定15-18
• 1.3.1 测量工具15-16
• 1.3.2 测定指标及方法16
• 1.3.3 数据统计16
• 1.3.4 试验结果16-18
• 1.4 讨论18-19
• 2 南方黄牛生长发育类激素水平分析19-25
• 2.1 试验仪器19-20
• 2.2 试验方法20-21
• 2.2.1 样品采集20
• 2.2.2 激素测定20
• 2.2.3 数据处理20-21
• 2.3 试验结果21-23
• 2.3.1 南方黄牛生长发育类激素水平比较21-22
• 2.3.2 南方黄牛激素水平变化结果22-23
• 2.4 讨论23-25
• 第三章 南方黄牛垂体组织转录组分析25-64
• 1. 试验材料25-27
• 1.1 试验动物和样品的采集25
• 1.2 主要仪器25-26
• 1.3 主要试剂26
• 1.4 主要数据库26
• 1.5 主要软件26-27
• 2. 试验步骤27-30
• 2.1 总RNA提取27
• 2.2 RNA质量检测27
• 2.3 cDNA文库的制备与测序27-28
• 2.4 实时荧光定量PCR验证28-30
• 2.4.1 RNA的提取与质量检测28
• 2.4.2 RNA的质量检测28
• 2.4.3 cDNA反转录28-29
• 2.4.4 荧光定量PCR反应29-30
• 3. 数据统计分析30-32
• 3.1 参考序列比对分析30
• 3.2 基因表达量分析30
• 3.3 差异表达基因的筛选30-31
• 3.4 差异表达基因的基因本体论(GO)功能分析31
• 3.5 差异表达基因KEGG通路分析31-32
• 4. 结果及分析32-59
• 4.1 总RNA质量检测32
• 4.2 测序数据质量评估32-36
• 4.2.1 测序错误率分布检查32-35
• 4.2.2 测序数据的过滤35-36
• 4.3 测序序列比对分析结果36-37
• 4.4 可变剪切分析37-38
• 4.5 单核苷酸多态性分析38
• 4.6 新转录本预测及基因结构优化38-39
• 4.6.1 新转录本结构注释38-39
• 4.6.2 已知基因结构优化结果39
• 4.7 基因表达水平分析39-40
• 4.8 基因差异表达分析40-50
• 4.8.1 差异表达分析41-43
• 4.8.2 差异基因聚类分析43-44
• 4.8.3 差异表达基因GO分析44-50
• 4.9 KEGG富集分析50-53
• 4.10 候选基因的KEGG富集分析53-54
• 4.11 候选基因共表达相关性分析54-55
• 4.12 生长发育类激素相关基因分析55-56
• 4.13 差异表达基因的实时荧光定量PCR验证56-59
• 4.13.1 引物设计56-57
• 4.13.2 目的基因与内参基因的溶解曲线57
• 4.13.3 转录组测序结果与实时定量结果的倍数差异比较57-59
• 5. 讨论59-64
• 5.1 差异表达基因的筛选59-60
• 5.2 差异表达基因GO富集分析60-61
• 5.3 差异表达基因KEGG功能富集分析61-62
• 5.4 生长发育类激素及其差异表达基因分析62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-70
• 致谢70-71
• 攻读学位期间发表和参与发表的学术论文目录71-72

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