麝香草酚对金葡菌诱发的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的保护作用及机制

发布时间：2017-10-18 23:16

  本文关键词：麝香草酚对金葡菌诱发的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的保护作用及机制

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【摘要】：奶牛乳腺炎是一种给奶牛养殖业和乳品行业造成巨大经济损失的主要疾病之一。它是一种由于物理、化学、病原微生物等刺激因素导致乳腺组织发生炎性反应疾病。奶牛乳腺炎发生后,乳腺组织的损伤往往引起奶牛产奶量减少和乳品质下降,严重时导致奶牛乳腺泌乳停止,产奶机能丧失,甚至奶牛遭淘汰。与临床型奶牛乳腺炎相比,隐性乳腺炎发病后除体细胞升高外,概无其它症状,单凭临床检查难以得到确诊,同时又因其着较高的发病率,往往造成的经济损失更为严重。金葡菌是引起隐性奶牛乳腺炎的重要病原之一,作为一种传染性的病原微生物,金葡菌通常被认为是一种胞外病原体,但有研究表明它能侵入乳腺上皮细胞并且在胞内存活,引起奶牛乳腺组织慢性、持续性感染,金葡菌本身具有很强的耐药性,再加上能够侵入细胞内存活,而使用抗生素治疗也很难根除,往往造成奶牛乳腺炎的反复发病,而且抗生素治疗极易造成药物残留,耐药菌株的出现甚至威胁人类健康。因而,在兽医生产实践中,亟需寻找既可以治疗奶牛乳腺炎又相对较安全的药物。中草药治疗奶牛乳腺炎具有明显的治疗效果,其不仅能避免应用抗生素导致耐药菌的产生,而且能避免药物残留等问题,因而应用中草药治疗奶牛乳腺炎一直被寄予厚望。麝香草酚是一种来源于百里香属和牛至属等传统中医药成分的单萜酚类天然化合物,因为其具有抗炎、抗寄生虫、抗氧化等生物活性,已被广泛应用于医药行业和兽医领域。但麝香草酚对金葡菌引起的奶牛乳腺炎影响还不清楚,本论文以麝香草酚为研究对象,通过分离培养原代奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)建立金葡菌体外感染模型,研究麝香草酚对金葡菌诱导bMEC炎症反应的保护作用及其机制,为临床应用麝香草酚治疗奶牛乳腺炎提供实验数据及参考。首先,建立金葡菌感染体外模型,观察了麝香草酚对金葡菌诱发的奶牛乳腺炎的保护作用。分光光度计法和MTT法分别检测麝香草酚对金葡菌和bMEC生长的影响;qRT-PCR法检测金葡菌诱导的bMEC炎性细胞因子的表达情况;最后,利用westernblotting法检测了麝香草酚对炎性细胞因子表达相关的NF-κB与MAPK信号通路的影响,以求初步阐述麝香草酚对金葡菌刺激的bMEC炎症反应保护作用的机制。结果显示,麝香草酚(16~64ug/ml)既不会影响金葡菌的生长,也不会对奶牛乳腺上皮细胞有毒性作用,而麝香草酚会剂量依赖性的降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,说明麝香草酚对金葡菌诱导的奶牛乳腺炎具有明显的保护作用。进一步的Westernblotting结果显示,麝香草酚可以显著地抑制与炎性细胞因子表达相关的p65、p38、JNK和ERK等关键蛋白的磷酸化水平,说明麝香草酚对金葡菌诱导的奶牛乳腺炎的保护作用是通过抑制NF-κB与MAPK信号通路实现的。其次,为了进一步研究麝香草酚对金葡菌刺激的bMEC炎症反应的保护作用机制,检测麝香草酚对bMEC吞噬金葡菌的影响,并探索其可能存在的机制。利用分光光度计法和MTT法分别检测麝香草酚对金葡菌生长和bMEC生长的影响;通过庆大霉素保护实验检测了麝香草酚对金葡菌侵入bMEC影响;为了探索麝香草酚抑制金葡菌侵入bMEC可能的机制,通过实时荧光定量法、Greiss法和westernblotting法分别检测麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的抗菌肽TAP和BNBD5表达情况、NO产生的情况以及NF-κB活性的影响。结果显示,麝香草酚在16~64ug/ml浓度范围内对金葡菌的生长没有影响,并且对bMEC也没有毒性作用。庆大霉素试验结果显示,与空白对照组相比,麝香草酚剂量依赖性地抑制金葡菌侵入bMEC的数量,而其机制可能与抑制NF-κB活性关系较大。为了验证推测,我们在有无NF-κB抑制剂SN50情况下,检测bMEC吞噬金葡菌的庆大霉素保护实验,结果显示,抑制剂SN50显著抑制金葡菌侵入bMEC的数目,说明麝香草酚抑制金葡菌侵入bMEC确实与抑制NF-κB活性相关。综上所述,我们初步揭示了麝香草酚对金葡菌诱导的奶牛乳腺炎的保护作用机制,一方面是通过抑制炎症信号通路而发挥抗炎作用,另一方面是通过抑制金葡菌的侵入bMEC而发挥保护作用。
【关键词】：奶牛乳腺炎 金葡菌 麝香草酚 NF-κB MAPK
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-14
• 第一篇 文献综述14-26
• 第一章 奶牛乳腺炎研究进展14-23
• 1.1 奶牛乳腺炎的危害14-16
• 1.1.1 发病率高14
• 1.1.2 产奶量和质量下降14-15
• 1.1.3 经济损失严重15
• 1.1.4 食品安全问题15-16
• 1.2 奶牛乳腺炎的病因16-19
• 1.2.1 病原微生物感染16-19
• 1.2.2 环境因素19
• 1.2.3 遗传因素19
• 1.2.4 饲养管理因素19
• 1.3 奶牛乳腺炎的分类19-20
• 1.3.1 临床型奶牛乳腺炎20
• 1.3.2 隐性奶牛乳腺炎20
• 1.4 奶牛乳腺炎的预防和治疗20-23
• 1.4.1 奶牛乳腺炎的预防20-21
• 1.4.2 奶牛乳腺炎的治疗21-23
• 第二章 麝香草酚的理化性质及药理作用23-26
• 2.1 麝香草酚的理化性质23
• 2.2 麝香草酚的药理作用23-26
• 2.2.1 抗炎作用23-24
• 2.2.2 免疫调节作用24
• 2.2.3 抗氧化作用24
• 2.2.4 抗菌作用24
• 2.2.5 防腐作用24-25
• 2.2.6 其他药理作用25-26
• 第二篇 实验部分26-51
• 第一章 麝香草酚对金葡菌刺激奶牛乳腺上皮细胞NF-ΚB和MAPKS信号通路的调节作用26-42
• 1.1 材料26-29
• 1.1.1 实验动物及实验菌株26-27
• 1.1.2 主要试剂及药品27
• 1.1.3 主要仪器设备27-28
• 1.1.4 所需试剂的配制28-29
• 1.2 方法29-35
• 1.2.1 原代bMEC分离与培养29-30
• 1.2.2 原代bMEC的鉴定30
• 1.2.3 金葡菌培养及菌落计数30-31
• 1.2.4 麝香草酚对金葡菌生长曲线和bMEC生长的影响31
• 1.2.5 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表达的影响31-33
• 1.2.6 麝香草酚对金葡菌刺激bME的NF-κB和MAPK信号通路关键接头蛋白的影响33-35
• 1.3 数据处理及统计35
• 1.4 结果35-40
• 1.4.1 奶牛原代乳腺上皮细胞鉴定35-36
• 1.4.2 金葡菌计数36-37
• 1.4.3 麝香草酚对金葡菌生长曲线和乳腺上皮细胞生长的影响37
• 1.4.4 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因水平表达的影响37-38
• 1.4.5 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的NF-κB信号通路的影响38-39
• 1.4.6 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的MAPK信号通路的影响39-40
• 1.5 讨论40-41
• 1.6 小结41-42
• 第二章 麝香草酚对BMEC吞噬金葡菌的影响42-51
• 2.1 材料42-43
• 2.1.1 实验菌株和细胞42
• 2.1.2 主要试剂及药品42
• 2.1.3 主要仪器设备42
• 2.1.4 所需试剂的配制42-43
• 2.2 方法43-44
• 2.2.1 麝香草酚对金葡菌生长曲线和bMEC生长的影响43
• 2.2.2 庆大霉素保护试验43
• 2.2.3 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的抗菌肽TAP和BNBD5表达的影响43-44
• 2.2.4 麝香草酚对bMEC的NO产生的影响44
• 2.2.5 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的NF-κB活性影响44
• 2.3 数据处理及统计44-45
• 2.4 结果45-49
• 2.4.1 麝香草酚对金葡菌生长曲线和bMEC生长的影响45
• 2.4.2 麝香草酚抑制金葡菌侵入bMEC45-46
• 2.4.3 麝香草酚对bMEC中抗菌肽TAP和BNBD5表达的影响46-47
• 2.4.4 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的NO表达量的影响47
• 2.4.5 麝香草酚对金葡菌刺激bMEC的NF-κB活性的影响47-49
• 2.5 讨论49-50
• 2.6 小结50-51
• 结论51-52
• 参考文献52-59
• 导师简介59-61
• 作者简介61-63
• 致谢63

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本文编号：1057695