抗猪流行性腹泻病毒猪源化嵌合单链抗体scFv-Fc的构建、表达及活性鉴定

发布时间：2017-10-19 05:09

  本文关键词：抗猪流行性腹泻病毒猪源化嵌合单链抗体scFv-Fc的构建、表达及活性鉴定

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【摘要】：目前,市场上预防猪流行性腹泻的主要疫苗均为弱毒苗和灭活苗,2010年冬季以来,猪流行性腹泻在我国又开始了爆发流行,即使是商品化的疫苗也难以快速控制该病的发展,说明主动免疫在免疫系统发育不健全的仔猪上难以发挥保护作用,因此,利用基因工程手段研发新型重组抗体进行被动免疫就成为了另外一个选择。本文在前人开发的抗PEDV杂交瘤细胞2D1的基础上,通过提取杂交瘤细胞总RNA,反转录获得全套cDNA,以此为模板,利用17对引物扩增重链可变区基因,利用19对引物扩增轻链可变区基因,筛选出2株VH序列和1株VL序列以及特异性扩增抗体可变区引物;另一方面,将原核表达的PEDV S1蛋白免疫昆明白鼠,获得阳性抗血清,提取脾细胞的总RNA,反转录全套cDNA,以此为模板,利用筛选出的特异性引物扩增抗体VH序列和VL序列,其中一株重链可变区单克隆SH2与杂交瘤细胞中抗体重链可变区基因序列VH5 100%相同,一株轻链可变区单克隆SL2与杂交瘤细胞中抗体轻链可变区基因序列VL匹配率达到97.18%,由此可以确定抗PEDV抗体的VH序列(366bp)和VL序列(354bp);与此同时,通过提取猪脾细胞总RNA,反转录全套cDNA,以此为模板,利用特异性引物扩增获得抗体Fc序列(363bp);通过SOE-PCR方法拼接得到单链抗体scFv(765bp)和scFv-Fc(1128bp),经过IgBlast分析后,两种单链抗体均具有典型结构域,构建原核表达载体pEASY-scFv和pET28a-sc Fv-Fc,通过原核表达系统对其进行分别表达,理论分子量分别为32KDa和45.8kDa,利用SDS-PAGE和Western-Blot方法对表达产物进行鉴定,通过间接Elisa鉴定该重组蛋白与PEDV的结合活性;最后,利用HRP anti-lebeled 6×His和HRP Goat anti-Swine两种抗体对scFv和sc Fv-Fc进行杂交。结果表明,通过原核表达产生的两种重组抗体均具有抗原结合活性,包含Fc段的sc Fv-Fc具有能被Goat anti-Swine抗体识别的特性,该研究为针对PEDV的重组抗体的研究奠定了理论基础,使用猪源Fc段对单链抗体的种属特异性进行了改造,具有较为深远的实际应用意义。
【关键词】：猪流行性腹泻 单链抗体 基因工程 SOE-PCR Western-Blot
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 致谢4-8
• 中文摘要8-9
• 英文缩略词表9-10
• 1 文献综述10-16
• 1.1 猪流行性腹泻病毒研究进展10-11
• 1.1.1 猪流行性腹泻概述10
• 1.1.2 猪流行性腹泻病毒概述10
• 1.1.3 PEDV疫苗的研究进展10-11
• 1.1.4 疫苗在PEDV防治过程中的不足11
• 1.2 单链抗体研究进展11-16
• 1.2.1 免疫球蛋白简介11-12
• 1.2.2 抗体的发展历程12-13
• 1.2.3 单链抗体简介13-14
• 1.2.4 单链抗体在原核表达系统中的表达14
• 1.2.5 单链抗体在真核表达系统中的表达14
• 1.2.6 猪源化嵌合单链抗体14-16
• 2 引言16-17
• 3 材料与方法17-43
• 3.1 实验材料17-20
• 3.1.1 菌株、载体、质粒及相关蛋白17
• 3.1.2 实验相关动物及组织17
• 3.1.3 杂交瘤细胞17
• 3.1.4 主要试剂及试剂盒17-18
• 3.1.5 主要实验仪器设备18-19
• 3.1.6 常用溶液配方19-20
• 3.2 实验方法20-43
• 3.2.1 从杂交瘤细胞中扩增抗体可变区基因20-26
• 3.2.2 小鼠免疫及抗体基因的克隆26-28
• 3.2.3 猪IgG Fc的克隆28-29
• 3.2.4 单链抗体基因scFv的构建、表达及检测29-38
• 3.2.5 猪源化单链抗体基因scFv-Fc的构建、表达及检测38-42
• 3.2.6 Western-Blot反应检测scFv蛋白和sc Fv-Fc蛋白的种属特异性42-43
• 4 结果与分析43-62
• 4.1 从杂交瘤细胞中扩增抗体基因43-47
• 4.1.1 杂交瘤细胞总RNA的提取及反转录cDNA43
• 4.1.2 扩增抗体重链可变区43-44
• 4.1.3 扩增抗体轻链可变区44-45
• 4.1.4 抗PEDV抗体重链可变区基因的序列测定及分析45-46
• 4.1.5 抗PEDV抗体轻链可变区基因的序列测定及分析46-47
• 4.2 从免疫小鼠脾脏中扩增抗体基因47-50
• 4.2.1 小鼠免疫47
• 4.2.2 小鼠脾脏总RNA提取及反转录cDNA47-48
• 4.2.3 确定抗PEDV抗体重链可变区基因和轻链可变区基因序列48-50
• 4.3 单链抗体基因scFv的构建、表达及鉴定50-55
• 4.3.1 SOE-PCR法构建scFv50-51
• 4.3.2 表达载体pEASY-scFv构建51
• 4.3.3 表达载体pEASY-scFv诱导表达51
• 4.3.4 IPTG诱导剂量与表达效率的关系51-52
• 4.3.5 IPTG诱导时间与表达效率的关系52-53
• 4.3.6 IPTG诱导温度与表达效率的关系53
• 4.3.7 Western-Blot检测目的蛋白53
• 4.3.8 目的蛋白的纯化53-54
• 4.3.9 Elisa检测54-55
• 4.4 猪源化嵌合单链抗体scFv-Fc的构建、表达及鉴定55-60
• 4.4.1 SOE-PCR法构建scFv-Fc55
• 4.4.2 pMD19-T-scFv-Fc和pET28a双酶切55-56
• 4.4.3 菌液PCR检测及单酶切鉴定56-57
• 4.4.4 IPTG诱导剂量与表达效率的关系57
• 4.4.5. IPTG诱导时间与表达效率的关系57-58
• 4.4.6 IPTG诱导温度与表达效率的关系58-59
• 4.4.7 确定目的蛋白表达形式59
• 4.4.8 Western-Blot检测目的蛋白59
• 4.4.9 目的蛋白纯化59-60
• 4.4.10 Elisa检测60
• 4.5 Western-Blot检测scFv和scFv-Fc单链抗体60-62
• 5 小结与讨论62-64
• 5.1 小结62
• 5.2 讨论62-64
• 参考文献64-70
• 附录:scFv-Fc基因序列70-72
• 作者读研期间发表文章72-73
• abstract73

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