新城疫病毒强弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及试剂盒的组装

发布时间：2017-10-19 06:23

  本文关键词：新城疫病毒强弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及试剂盒的组装

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【摘要】：新城疫(Newcastle Disease)是由新城疫病毒引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性禽类传染病,严重危害禽类健康,其发病率和死亡率都很高。近几年,新城疫的发病情况和流行态势日益复杂,新城疫病毒强弱毒株混合感染在禽群中越来越常见,区分新城疫病毒强弱毒株在新城疫诊断与防控上也越来越受到重视。常见的实验室检测新城疫强、弱毒的方法耗时耗力难以满足需求,如鸡胚平均死亡时间(MDT)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)等。与这些方法相比荧光定量RT-PCR方法省时省力、操作简便、安全可靠,并且特异性、敏感性优异。近年来,国外虽有利用多重荧光定量RT-PCR检测方法区分新城疫病毒强、弱毒株的研究,但国外新城疫流行株的基因型与我国当前新城疫流行株的基因型(Ⅶ型)存在着一定的差异。目前国内市场上还未出现快速鉴别新城疫病毒强、弱毒株的试剂盒,因此建立荧光定量RT-PCR检测新城疫病毒强、弱毒株的方法及组装试剂盒迫在眉睫。本实验通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计了数对探针和引物。通过筛选两组探针及引物,选择NDV-F和NDV-R作为最佳引物组,NDV-V-Probe和NDV-L-Probe作为最佳的探针组;确定最佳的反应条件及反应体系,其中最佳退火温度为56℃,NDV-F、NDV-R的终浓度为0.6μM,NDV-V-Probe、NDV-L-Probe的终浓度分别为0.6μM和0.2μM。建立了新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法,根据所建立的检测方法组装成试剂盒,检验试剂盒的特异性、敏感性、重复性等参数,并确定试剂盒的保存期和保存条件。该实验所建立的方法以及根据该方法组装的试剂盒对NDV NA-1株RNA标准品的最小检出量均为102copies/μL,对NDV La Sota株RNA标准品的最小检出量均为101copies/μL,用组装成的试剂盒检测临床样品,阳性检出率高于国家标准的检测新城疫RT-PCR方法,具有良好的应用价值。
【关键词】：新城疫病毒 荧光定量RT-PCR 诊断 试剂盒
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 引言9-10
• 第一篇 文献综述10-25
• 第1章 新城疫概述10-18
• 1.1 历史回顾10
• 1.2 病原学10-12
• 1.3 分子流行病学12-13
• 1.4 临床症状及病变13-14
• 1.5 致病机理14
• 1.6 防制及疫苗发展趋势14-18
• 第2章 新城疫诊断技术18-24
• 2.1 病毒的分离与鉴定18
• 2.2 血清学检测技术18-20
• 2.3 分子生物学技术20-24
• 研究的目的与意义24-25
• 第二篇 研究内容25-45
• 第1章 新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立25-37
• 1.1 材料25
• 1.2 方法25-28
• 1.3 结果28-34
• 1.4 讨论34-35
• 1.5 小结35-37
• 第2章 试剂盒的组装及应用37-45
• 2.1 材料37
• 2.2 方法37-38
• 2.3 实验结果38-43
• 2.4 讨论43-44
• 2.5 小结44-45
• 结论45-46
• 参考文献46-51
• 导师简介51-53
• 作者简介53-54
• 致谢54

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