2011-2015我国部分地区鸽源新城疫病毒分子流行病学调查及鸽新城疫疫苗VIb-I4的免疫效力试验

发布时间：2017-10-19 07:28

  本文关键词：2011-2015我国部分地区鸽源新城疫病毒分子流行病学调查及鸽新城疫疫苗VIb-I4的免疫效力试验

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【摘要】：鸽新城疫(Newcastle Disease, ND)是由鸽新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起的一种高度接触性病毒性传染病,其临床表现与鸡新城疫非常相似。鸽新城疫于上世纪80年代传入我国,对我国养鸽业的健康发展构成了巨大威胁。为了解鸽群中NDV的遗传变异规律,本文对2011-2015年从我国部分地区分离的11株鸽NDV进行了遗传进化分析,并测定了部分毒株的生物学特性。同时为进一步探究鸽源NDV的致病机理并丰富其基因信息库,本研究选取了不同地点分离到的2株毒力不一致的鸽源NDV进行了全基因组序列的测定和分析。另外,根据鸽源NDV的分子流行病学研究结果,针对当前缺少专门用于鸽新城疫预防疫苗的现状,本文还对我室研制的鸽新城疫疫苗株VIb-I4开展了免疫效力试验研究。1.鸽源新城疫病毒的分离鉴定及分子流行病学2011-2015年从我国部分地区发病鸽的病料中共分离到鸽新城疫病毒11株。F及HN基因序列的遗传进化分析表明所有分离株均属基因VIb亚型,证实目前我国鸽群中的ND仍然由VIb亚型NDV引起,该亚型毒株具有明显的宿主亲嗜性。11株鸽源NDV的F及HN基因核苷酸序列的同源性分别是94.3-99.3%和93.9-99.9%,与欧洲近期型毒株(EU/re)处于同一分支。分离株与目前广泛使用的疫苗株La Sota遗传距离较远,11株病毒与La Sota的F及HN基因核苷酸序列同源性分别为83.9-84.9%和82.7-83.6%,氨基酸序列同源性分别为88.4-89.4%和87.4-88.5%。11株NDV的F蛋白裂解位点序列均为112R-R-Q-K-R-F117,呈典型的强毒特征,但这11株病毒的MDT值从50h到114h不等,ICPI从0.98到1.51不等,说明毒株间的毒力差异较大,因此F蛋白裂解位点序列并不是新城疫病毒毒力的唯一决定因素。分离株与La Sota相比在HN蛋白抗原区及附近位点存在12个氨基酸位点差异,其中4个为保守性替换,其余分别涉及极性,电荷,结构的改变。第347位氨基酸位于HN蛋白的线性抗原表位,分离株与La Sota相比在该位点发生了E347G的替换,并且单抗6B1与分离株反应的HI效价也比其与La Sota低6个滴度。病毒中和试验结果显示,分离株NT-23-11-Pi与La Sota的抗原相似系数R值为0.42,证明两者间存在显著的抗原性差异。对分离自不同地区且毒力有差异的NT-23-11-Pi及ZJ-08-13-Pi进行全基因组序列测定,结果表明两株病毒基因组全长为15192nt,遗传进化分析表明两株病毒处于EU/re这个分支。两株病毒NP、P、M、F、HN、L蛋白氨基酸序列的同源性分别为为99%、97%、99.5%、98.6%、99.5%和99.6%,共有25个氨基酸差异位点涉及到极性及结构的变化,这些位点为VIb亚型NDV毒力分子机制的研究提供了有益参考。2.鸽新城疫灭活疫苗VIb-I4的免疫效力试验目前我国对新城疫的防控主要依靠免疫接种,但目前我国尚无针对鸽新城疫的疫苗产品。前期,本室利用反向遗技术成功研制出了专用于鸽新城疫预防的灭活疫苗VIb-I4,为了加速该疫苗的产业化,本文对其开展了鸽新城疫灭活疫苗(VIb-I4)免疫效力试验研究。首先将疫苗株VIb-I4在鸡胚上连续传15代,测定第1、5、10、15代次病毒的毒力和F蛋白裂解位点的氨基酸序列,数据显示疫苗株VIb-I4经鸡胚连续传代后,其毒力测定指标和F蛋白裂解位点序列均符合典型的弱毒特征,表明疫苗株具有良好的遗传稳定性；同时疫苗毒株在鸡胚上具有较强的繁殖性能,疫苗毒尿囊液的HA效价至91og2,病毒含量高于109.0EID50/0.1ml。在生物学特性测定的基础上,我们选取了4株VIb亚型NDV分离株对鸽进行致病性实验,并从中筛选获得了用于疫苗效力试验的检验强毒株NT-23-11-Pi,该毒株以106EID5o的剂量攻毒时可导致非免疫鸽产生80%的死亡率,试验鸽在攻毒后的第15天仍可检测到排毒。最小免疫剂量试验结果表明VIb-I4灭活疫苗的最小免疫为200μl,以该剂量免疫后5周,免疫鸽ND平均抗体效价可达到71og2以上,并可有效抵御检验强毒的攻击。另外,与传统疫苗株La Sota灭活疫苗相比,以VIb-I4研制的灭活疫苗免疫鸽后诱导抗体产生的效价高,具备更强的免疫保护效力,因此该灭活疫苗显示出了广阔的应用前景。
【关键词】：鸽 新城疫病毒 遗传进化 疫苗 免疫效力
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.39
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 符号说明10-12
• 综述 鸽新城疫研究进展12-23
• 1. 新城疫病毒概述12
• 2. 新城疫病毒的毒力12-13
• 3. 新城疫病毒各基因及其编码的蛋白13-17
• 4. 鸽新城疫研究进展17-21
• 4.1 鸽新城疫的流行病学17-18
• 4.2 鸽新城疫的临床症状18
• 4.3 PPMV-1的毒力18-20
• 4.4 PPMV-1的诊断20-21
• 5. 鸽新城疫疫苗研究21-23
• 第一章 2011-2015年我国部分地区鸽源新城疫病毒分子流行病学研究23-45
• 1 材料23-24
• 1.1 病毒、实验动物和细胞23
• 1.2 主要试剂23-24
• 1.3 主要仪器24
• 1.4 分子生物学软件24
• 2. 方法24-33
• 2.1 病毒的分离与鉴定24
• 2.2 病毒的纯化24
• 2.3 病毒RNA提取及反转录24-25
• 2.4 PCR反应25-26
• 2.5 PCR产物回收和测序26
• 2.6 病毒F基因及HN基因片段的序列分析26-27
• 2.7 病毒毒力测定27
• 2.8 分离株与疫苗株LaSota株的抗原性差异27-28
• 2.9 两株VIb亚型NDV全基因组序列的测定28-33
• 3. 实验结果33-42
• 3.1 病毒的分离鉴定33
• 3.2 F基因序列分析33-34
• 3.3 HN基因序列分析34-35
• 3.4 HN基因序列分析35-37
• 3.5 全基因序列分析37-42
• 4. 讨论42-45
• 第二章 新鸽新城疫疫苗VIb-I4的免疫效力试验45-67
• 1 材料45-46
• 1.1 病毒、实验动45
• 1.2 主要试剂45
• 1.3 主要仪器45-46
• 1.4 分子生物学软件46
• 2 方法46-50
• 2.1 疫苗株VIb-I4在鸡胚上的连续传代46
• 2.2 传代病毒生物学特性的测定及F基因序列的扩增46
• 2.3 检验强毒的筛选46
• 2.4 光定量PCR检测方法的建立46-49
• 2.5 最小免疫剂量试验49-50
• 2.6 VIb-I4与LaSota免疫效果对比试验50
• 3. 结果50-58
• 3.1 遗传稳定性试验50
• 3.2 荧光定量检测方法的建立50-53
• 3.3 检验强毒的筛选53-56
• 3.4 最小免疫剂量试验56-58
• 3.5 VIb-I4与LaSota免疫效果对比试验58
• 4. 讨论58-61
• 参考文献61-67
• 全文小结67-68
• 致谢68-69
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录69-70

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