FAK信号通路调控猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附的分子机制

发布时间：2017-10-19 10:37

  本文关键词：FAK信号通路调控猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附的分子机制

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【摘要】：为研究不同品种猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附差异的分子机制,本试验以华南地方品种蓝塘猪和外来品种长白猪背最长肌的骨骼肌卫星细胞为试验材料,利用细胞划痕试验和transwell小室迁移试验,比较两品种猪骨骼肌卫星细胞的迁移能力;细胞外基质(Fn)-细胞粘附试验,比较两品种猪骨骼肌卫星细胞的粘附能力;运用细胞免疫荧光技术,检测两品种猪骨骼肌卫星细胞粘着斑和F-肌动蛋白的表达;采用Western blot技术,检测两种卫星细胞迁移24 h和粘附2 h时间点FAK/paxillin信号通路的蛋白表达情况,结合实时荧光定量PCR技术检测两种卫星细胞粘附2 h时整合素(ITGB)关键基因的表达;同时以蓝塘猪骨骼肌卫星细胞为材料,选用p-FAK特异性抑制剂PF-573228,分别以0、5和10μmol/L浓度处理蓝塘猪骨骼肌卫星细胞24 h,检测其对卫星细胞迁移和粘附的影响,以及粘着斑、F-肌动蛋白和FAK信号通路相关蛋白的表达变化。试验结果如下:(1)细胞划痕试验和transwell小室迁移试验表明,蓝塘猪骨骼肌卫星细胞的迁移能力显著强于长白猪骨骼肌卫星细胞(P0.05);细胞外基质-细胞粘附试验表明,蓝塘猪骨骼肌卫星细胞的粘附能力显著强于长白猪骨骼肌卫星细胞(P0.05)。(2)细胞免疫荧光结果表明,相比于长白猪骨骼肌卫星细胞,蓝塘猪骨骼肌卫星细胞的粘着斑表达更丰富,而F-肌动蛋白的表达量更低。(3)蓝塘猪骨骼肌卫星细胞在迁移24 h的p-FAK(Tyr397)和p-paxillin(Tyr118)蛋白表达显著高于长白猪骨骼肌卫星细胞(P0.05);蓝塘猪骨骼肌卫星细胞在粘附2 h的p-FAK(Tyr397),p-paxillin(Tyr118)和p-Akt(Ser473)蛋白表达显著高于长白猪骨骼肌卫星细胞(P0.05),粘附基因ITGB3存在差异的趋势(P=0.053)。(4)以10μmol/L PF573228浓度处理蓝塘猪骨骼肌卫星细胞24 h,能显著抑制p-FAK(Tyr397)的蛋白表达;且5和10μmol/L PF-573228处理能显著抑制骨骼肌卫星细胞的迁移能力(P0.05),骨骼肌卫星细胞在10μmol/L PF-573228处理浓度下,细胞粘附能力受到抑制(P0.05)。(5)与对照组相比,PF-573228以5和10μmol/L浓度处理卫星细胞能降低粘着斑的数量,抑制p-paxillin(Tyr118)和p-Akt(Ser473)的蛋白表达(P0.05),不影响F-肌动蛋白的变化。以上结果说明:蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附的差异与粘着斑和F-肌动蛋白的形成密切相关,FAK/paxillin信号通路可能参与两品种骨骼肌卫星细胞迁移和粘附差异的调控。
【关键词】：FAK 猪骨骼肌卫星细胞 细胞迁移 粘着斑 F-肌动蛋白
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩写词表7-10
• 1 前言10-13
• 2 材料与方法13-27
• 2.1 主要设备13
• 2.2 试剂与用品13-16
• 2.2.1 试剂13-14
• 2.2.2 主要试验用品耗材14
• 2.2.3 试验用品的清洗与消毒14
• 2.2.4 主要试剂的配制14-16
• 2.3 细胞模型16
• 2.4 试验方法16-26
• 2.4.1 蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞分离和鉴定16-17
• 2.4.2 蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞培养和传代17
• 2.4.3 猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附能力测定17-18
• 2.4.4 细胞免疫荧光18
• 2.4.5 F-肌动蛋白染色18-19
• 2.4.6 抑制剂添加试验19
• 2.4.7 总RNA抽提、DNase I消化、CDNA反转录和基因芯片试验19-23
• 2.4.8 Western blot检测目的蛋白23-26
• 2.5 数据处理26-27
• 3 结果与分析27-34
• 3.1 蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞的鉴定27
• 3.2 总RNA样品的质量检测27-28
• 3.3 蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞迁移能力比较28-29
• 3.4 蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞粘附能力比较29
• 3.5 细胞免疫荧光检测卫星细胞F-肌动蛋白和粘着斑29-30
• 3.6 卫星细胞迁移 24 h时FAK信号通路关键蛋白表达30
• 3.7 卫星细胞粘附 2 h时FAK信号通路关键基因表达30-31
• 3.8 p-FAK抑制剂PF-573228处理对卫星细胞迁移和粘附的影响31-33
• 3.9 p-FAK抑制剂PF-573228处理对FAK下游信号的影响33-34
• 4 讨论34-38
• 4.1 猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附34
• 4.2 FAK/paxillin信号通路调控猪骨骼肌卫星细胞迁移34-35
• 4.3 Integrin/ FAK/paxillin信号通路调控猪骨骼肌卫星细胞的粘附35-36
• 4.4 猪骨骼肌卫星细胞骨架与粘着斑36
• 4.5 FAK信号通路参与骨骼肌发育36-37
• 4.6 PF-573228抑制剂对猪骨骼肌卫星细胞迁移和粘附的影响37-38
• 5 结论38-39
• 致谢39-40
• 参考文献40-44
• 附录44

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 马喜山;猪骨骼肌发育相关基因的差异表达和多态性研究[D];中国农业科学院;2011年

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本文编号：1060620