山东省貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及三价灭活菌对小鼠的免疫效力评价

发布时间：2017-10-20 10:02

  本文关键词：山东省貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及三价灭活菌对小鼠的免疫效力评价

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【摘要】：水貂出血性肺炎是一种由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)引起的以肺部瘀血、败血症为主要特征的水貂急性呼吸道传染病。该病以地方性流行为主,发病迅速,病死率高,常造成水貂养殖业巨大的经济损失。由于该病病原菌存在广泛,耐药菌株较多,致使貂感染发病后药物治疗效果不佳。目前认为,防治该病的主要措施是应用与致病菌血清型相匹配的灭活菌进行免疫接种。因此,水貂出血性肺炎流行地区的致病菌分离鉴定,血清型调查是制备多价灭活疫苗的前提和基础。本研究开展了山东省水貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定、病原菌血清型分布调查和三价灭活菌对小鼠的免疫效力检测等方面的研究。病原菌分离鉴定。2013年至2014年,从山东省诸城、潍坊、临沂、文登、日照、莒县、胶南等地区的18个养貂场共采集77份病貂肺脏样本,分离得到120株疑似铜绿假单胞菌。经生化试验、16S r DNA的PCR扩增和血清型鉴定,最终确定其中53株分离菌为铜绿假单胞菌,分离率为44.2%(53/120)。53株铜绿假单胞菌包含11个已知血清型和一株未确定型。其中G型菌株最多,有27株;其次为B型、D型,分别为5株和4株。分离菌株中主要流行血清型为G型、B型和D型。免疫原的筛选。将分属于11个血清型的15株铜绿假单胞菌分别用甲醛灭活,与佐剂混合后对新西兰白兔连续免疫三次,采集免疫血清。用免疫血清分别与15株菌做交叉凝集试验,结果显示,G型、B型、D型、N型血清与多种血清型的菌株发生凝集。依据血清型鉴定结果和血清学交叉保护结果确定可以作为水貂出血性肺炎灭活疫苗的血清型为G、B、D型。通过血清交叉凝集试验、对小鼠半数致死量测定和生长曲线测定,确定了候选疫苗株为SD004、SD050、SD052。三价灭活菌免疫效力检测。测定候选株SD004、SD050、SD052传代稳定性,结果显示候选株SD004、SD050、SD052在20代内连续传代菌体含量虽有所变化,但都在同一数量级内浮动;20代内3株疫苗候选株致病性也在同一数量级内波动,3株候选株20代内的生长性能、致病性均稳定;对三株疫苗株进行包括培养基的选择,培养温度、时间、培养基p H等培养条件的优化,发现37℃条件下p H7.0~7.5的肉汤培养基中培养22~24h对候选株菌液生产应用最适宜;分别用相同菌体含量不同免疫剂量的三价灭活菌免疫昆明鼠,21 d后用10 LD5 0的候选株菌液攻毒,确定疫苗对小鼠的最小免疫剂量为0.15m L,即接种1.125×1011CFU三价灭活菌可以保证小鼠受到100%保护;小鼠肺脏病理组织学观察发现疫苗免疫剂量的增强可以有效保护小鼠,预防铜绿假单胞菌的感染;血清抗体水平检测表明水貂出血性肺炎三价灭活菌免疫小鼠后在28 d血清抗体达到峰值,42 d开始下降,49 d仍能检测到抗体存在;同时发现对小鼠两次免疫血清抗体滴度比一次免疫的抗体滴度要高,保护效果更好;将三价灭活菌0.15m L/只免疫昆明鼠,21 d后攻毒,小鼠无一死亡,证明其受到100%免疫保护。同时剖取免疫组小鼠的肺、肾、肝等内脏,发现免疫过三价灭活菌的小鼠攻毒后小鼠内脏无明显病理学变化,进一步证明三价灭活菌可以对小鼠提供有效保护。本研究证明,通过血清学调查并对优势流行菌株进行生物学特性的检测,获得分离菌株具有良好的免疫原性,诱导小鼠产生良好的免疫应答,可以作为预防水貂出血性肺炎流行的候选疫苗菌株。
【关键词】：铜绿假单胞菌 血清型 水貂出血性肺炎 疫苗
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-21
• 1.1 铜绿假单胞菌概述12-16
• 1.1.1 分类及其理化特性12
• 1.1.2 铜绿假单胞菌分型12-14
• 1.1.3 致病性及毒力因子14-15
• 1.1.4 耐药性15-16
• 1.2 水貂出血性肺炎及其防治16-20
• 1.2.1 病原16
• 1.2.2 流行病学和临床症状16-17
• 1.2.3 发病机制和病理变化17
• 1.2.4 诊断17-18
• 1.2.5 防治18-20
• 1.3 研究目的与意义20-21
• 2 材料与方法21-29
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 病料样本、参考菌株和实验动物21
• 2.1.2 主要试剂和培养基21
• 2.1.3 DNA扩增引物21-22
• 2.1.4 主要仪器22
• 2.2 实验方法22-29
• 2.2.1 病原菌的分离鉴定22-23
• 2.2.2 分离菌部分生物学特性检测23-24
• 2.2.3 疫苗候选菌株培养及灭活条件优化24-25
• 2.2.4 候选菌株传代稳定性检测25-26
• 2.2.5 灭活菌的制备及免疫效力检测26-29
• 3 结果29-49
• 3.1 细菌的分离鉴定29-36
• 3.1.1 分离菌的染色镜检和培养特性29-31
• 3.1.2 生化鉴定31-32
• 3.1.3 PCR鉴定32-34
• 3.1.4 血清型鉴定34-36
• 3.2 分离株部分生物学特性检测36-39
• 3.2.1 标准曲线测定36-37
• 3.2.2 血清交叉凝集试验37
• 3.2.3 致病性测定37-39
• 3.2.4 生长曲线测定39
• 3.3 疫苗株培养条件及甲醛灭活浓度优化39-42
• 3.3.1 培养基的选择39-40
• 3.3.2 培养温度确定40
• 3.3.3 培养基p H的确定40-41
• 3.3.4 培养时间确定41-42
• 3.3.5 甲醛灭活浓度确定42
• 3.4 候选菌株传代稳定性检测42-44
• 3.4.1 传代菌生长稳定性42-43
• 3.4.2 传代菌致病性43
• 3.4.3 传代菌对小鼠的免疫保护43-44
• 3.5 三价灭活菌免疫效力检测44-49
• 3.5.1 三价灭活菌制备及检验44
• 3.5.2 最小免疫剂量确定44-46
• 3.5.3 三价灭活菌对小鼠免疫保护46-49
• 4 讨论49-52
• 4.1 细菌的分离鉴定49
• 4.2 三价灭活菌候选菌株的选择49-50
• 4.3 候选菌株致病性和传代稳定性50
• 4.4 三价灭活菌对小鼠免疫效力评估50-52
• 5 结论52-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-63
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文63

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本文编号：1066655