鹌鹑Leptin及其受体基因的克隆及功能研究

发布时间：2017-10-20 13:00

  本文关键词：鹌鹑Leptin及其受体基因的克隆及功能研究

  更多相关文章： 鹌鹑 Leptin LEPR 基因克隆 可变剪接 生物学调控

【摘要】：自1998年“鸡Leptin基因”被首次报道以来,鸡Leptin基因序列的正确性,甚至Leptin是否在家禽中存在就一直备受争议。虽然家禽中Leptin受体(LEPR)的存在被广泛证实,但对其功能的研究却由于内源性Leptin的缺乏而受到限制。直到2014年,野生鸟类Leptin基因的成功克隆,部分回答了禽类中是否存在Leptin基因这一长久困扰禽类Leptin/LEPR研究的问题,克服了禽类Leptin/LEPR研究的瓶颈。自此,Leptin/LEPR在禽类尤其是家禽中的克隆和功能研究成为目前研究的热点。本研究在公开数据库序列搜索和分析的基础上,首先对鹌鹑Leptin及其受体LEPR基因进行克隆和结构分析,并采用实时荧光定量PCR的方法对其组织表达模式进行研究;以3周龄(未开产)和20周龄(高产期)的朝鲜龙城黄羽母鹌鹑为研究对象,对其性腺轴上的繁殖相关基因及Leptin/LEPR在两个发育阶段的表达差异进行检测,探究Leptin/LEPR与鹌鹑繁殖调控的关系;以3周龄朝鲜龙城母鹌鹑为研究对象,对其进行禁食和禁食后恢复采食处理,分析不同处理条件下促食欲基因、抑食基因以及Leptin/LEPR的差异表达情况,探究Leptin/LEPR与鹌鹑采食调控的关系。主要得到以下结果:1.运用已公布的禽类Leptin序列在日本鹌鹑的SRA数据库中进行同源序列查找,根据拼接获得的鹌鹑Leptin序列设计PCR引物,首次克隆了鹌鹑Leptin基因外显子4(参照野生鸟类的基因结构)的部分核苷酸序列;序列分析表明其GC含量较高(64%),其预测氨基酸序列与其他脊椎动物Leptin的氨基酸序列一致性较低,但拥有保守的结构域。2.运用兼并引物设计和PCR克隆技术,首次克隆得到了鹌鹑LEPR的CDS序列,同时鉴定出该受体的四种不同的剪接亚型,其中qLEPRl属于长型受体,其预测氨基酸序列包含信号转导所需的所有保守的基序、结构域和基本的残基,而其他三种亚型(qLEPR-a、qLEPR-b和qLEPR-c)属于可溶型受体,缺乏跨膜域和胞内域,同时也缺乏Leptin的绑定结合域;基因进化分析表明,鹌鹑LEPR与Leptin在脊椎动物中的进化关系相似,其与家禽尤其是鸡形目的物种同源性最高。3.运用实时荧光定量PCR技术对已获得的Leptin/LEPR进行组织表达模式的研究,结果表明,鹌鹑Leptin和LEPR呈广泛性组织表达特点,提示其具有广泛的生物学功能。鹌鹑Leptin在骨骼肌、胰腺和下丘脑中表达相对较高,而LEPR在垂体中极高表达,提示Leptin/LEPR在鹌鹑的脑部能量平衡的控制、繁殖调控以及肌肉发育方面扮演重要角色。鹌鹑Leptin/LEPR在肝脏和脂肪组织中低表达,表明鹌鹑Leptin不是一个脂肪依赖性分泌的激素。4.通过对繁殖相关基因和Leptin/LEPR在鹌鹑不同发育阶段差异表达的研究,初步探究了Leptin/LEPR与鹌鹑繁殖调控的关系,结果显示,与3周龄鹌鹑相比,20周龄鹌鹑繁殖相关基因(GnRH-I、FSH-β、FSHR和LHR)在性腺轴上显著上调表达,其性腺轴被激活,此时,Leptin和t-qLEPR(包含鹌鹑LEPR的所有亚型)在其下丘脑和垂体中也上调表达,表明Leptin/LEPR与鹌鹑的性腺轴激活存在一定的正相关关系;伴随着鹌鹑的性成熟并进入产蛋高峰期,促卵泡发育和卵巢激素分泌的基因(如:LHR和FSHR)上调表达,然而Leptin和t-qLEPR在20周龄鹌鹑的卵巢中表达下调,同时凋亡基因caspase3在其卵泡中的表达也下调,表明Leptin/LEPR系统对鹌鹑卵泡的发育有一定的抑制效应。5.本试验通过对3周龄鹌鹑进行禁食和禁食后恢复采食处理,并检测其促食欲基因(AgRP/NPY)、厌食基因(POMC和MC4R)和Leptin/LEPR的差异表达情况,初步探究了Leptin/LEPR系统与鹌鹑采食调控的关系,结果显示,AgRP/NPY在禁食阶段显著上调,在恢复采食时显著下调;POMC和MC4R在禁食和恢复采食阶段不同程度的下调;而Leptin/LEPR的表达在禁食时上调,恢复采食时下调;这些结果表明Leptin可能不作为抑食因子参与鹌鹑的食欲调控。综上所述,鹌鹑Leptin及其受体LEPR被首次克隆获得,拥有不同于其他动物同源物的独特的组织表达模式;鹌鹑Leptin不是一个脂肪或肝脏依赖性分泌的激素,其在鹌鹑的脑部能量平衡的控制、繁殖调控以及肌肉发育方面扮演重要角色;Leptin/LEPR系统与鹌鹑的性腺轴激活存在一定的正相关关系,同时对鹌鹑卵泡的发育有一定的抑制效应;Leptin可能不作为抑食因子参与鹌鹑的食欲调控。
【关键词】：鹌鹑 Leptin LEPR 基因克隆 可变剪接 生物学调控
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S839
【目录】：

• 致谢4-11
• 摘要11-13
• 1 文献综述13-22
• 1.1 Leptin及其受体的发现与结构13-15
• 1.1.1 Leptin的发现与结构13-14
• 1.1.2 LEPR的发现与结构14-15
• 1.2 Leptin及其受体的分子调控机制15-18
• 1.2.1 Leptin/LEPR介导JAK-STAT信号通路16-17
• 1.2.2 Leptin/LEPR介导AMPK信号转导途径17-18
• 1.3 禽类Leptin及LEPR的研究进展18-22
• 1.3.1 禽类Leptin/LEPR基因的分子克隆18-19
• 1.3.1.1 禽类Leptin基因的分子克隆18-19
• 1.3.1.2 禽类LEPR基因的分子克隆19
• 1.3.2 禽类Leptin/LEPR的组织表达模式19
• 1.3.3 禽类“Leptin/LEPR的生理功能”19-22
• 1.3.3.1 采食与能量调控20
• 1.3.3.2 生长发育20-21
• 1.3.3.3 繁殖调控21
• 1.3.3.4 小结21-22
• 2 引言22-23
• 3 鹌鹑Leptin及LEPR基因的分子克隆及生物信息学分析23-39
• 3.1 试验材料23-24
• 3.1.1 试验动物23
• 3.1.2 试验主要试剂及配制23
• 3.1.3 主要仪器设备23-24
• 3.2 试验方法24-28
• 3.2.1 基因组DNA的提取及检测24-25
• 3.2.1.1 基因组DNA的提取24-25
• 3.2.1.2 基因组DNA质量检测25
• 3.2.2 组织总RNA的提取检测及cDNA的合成25-26
• 3.2.2.1 组织总RNA的提取25
• 3.2.2.2 组织总RNA质量检测25-26
• 3.2.2.3 cDNA的合成26
• 3.2.3 鹌鹑Leptin及LEPR基因的克隆及测序26-28
• 3.2.3.1 引物设计与合成26-27
• 3.2.3.2 PCR反应条件27-28
• 3.2.3.3 PCR产物检测纯化与测序28
• 3.2.4 生物信息学和进化分析28
• 3.3 结果与分析28-37
• 3.3.1 基因组DNA与组织RNA质量检测28-29
• 3.3.1.1 基因组DNA质量检测28
• 3.3.1.2 组织RNA质量检测28-29
• 3.3.2 鹌鹑Leptin基因的克隆及结构特点29-30
• 3.3.3 鹌鹑LEPR基因不同剪接亚型的克隆与鉴定30-35
• 3.3.4 Leptin及LEPR基因的分子进化分析35-37
• 3.4 讨论37-38
• 3.5 小结38-39
• 4 鹌鹑Leptin/LEPR组织表达模式研究39-45
• 4.1 试验材料39
• 4.1.1 试验样品39
• 4.1.2 试验主要试剂及配制39
• 4.1.3 主要仪器39
• 4.2 试验方法39-41
• 4.2.1 组织总RNA的提取39
• 4.2.2 组织总RNA质量检测39
• 4.2.3 cDNA的合成39
• 4.2.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）特异性引物设计39-40
• 4.2.5 qRT-PCR引物特异性检测40
• 4.2.6 qRT-PCR反应40
• 4.2.7 目的基因的计算方法选择40-41
• 4.2.8 数据分析41
• 4.3 结果与分析41-43
• 4.3.1 组织RNA质量检测41
• 4.3.2 引物特异性检测41
• 4.3.3 鹌鹑Leptin/LEPR的组织表达41-43
• 4.4 讨论43-44
• 4.4.1 鹌鹑Leptin/LEPR的组织表达模式43
• 4.4.2 Leptin/LEPR在鹌鹑垂体和下丘脑中的表达43-44
• 4.4.3 Leptin/LEPR在鹌鹑脂肪和肝脏组织中的表达44
• 4.5 小结44-45
• 5 Leptin/LEPR与鹌鹑繁殖调控的关系45-51
• 5.1 试验材料45
• 5.1.1 试验样品45
• 5.1.2 试验主要试剂及配制45
• 5.1.3 主要仪器45
• 5.2 试验方法45-46
• 5.2.1 组织总RNA的提取45
• 5.2.2 组织总RNA质量检测45
• 5.2.3 cDNA的合成45
• 5.2.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物设计45-46
• 5.2.5 qRT-PCR引物特异性检测46
• 5.2.6 qRT-PCR反应46
• 5.2.7 数据分析46
• 5.3 结果与分析46-49
• 5.3.1 组织RNA质量检测46-47
• 5.3.2 引物特异性检测47
• 5.3.3 鹌鹑性腺轴上繁殖相关基因的验证47-48
• 5.3.4 Leptin/LEPR在鹌鹑不同发育阶段的差异表达48-49
• 5.4 讨论49-50
• 5.4.1 鹌鹑Leptin/LEPR系统与繁殖轴的激活作用49
• 5.4.2 鹌鹑Leptin/LEPR系统与卵泡发育的关系49
• 5.4.3 Leptin/LEPR系统在鹌鹑高产期脂质代谢中的作用49-50
• 5.5 小结50-51
• 6 Leptin/LEPR与鹌鹑采食调控的关系51-58
• 6.1 试验材料51
• 6.1.1 试验动物51
• 6.1.2 试验主要试剂及配制51
• 6.1.3 主要仪器51
• 6.2 试验方法51-53
• 6.2.1 组织总RNA的提取51-52
• 6.2.2 组织总RNA质量检测52
• 6.2.3 cDNA的合成52
• 6.2.4 qRT-PCR引物设计52
• 6.2.5 qRT-PCR引物特异性检测52
• 6.2.6 qRT-PCR反应52
• 6.2.7 数据分析52-53
• 6.3 结果与分析53-55
• 6.3.1 组织总RNA质量检测53
• 6.3.2 引物特异性检测53
• 6.3.3 禁食和禁食后恢复采食对食欲因子表达影响53-54
• 6.3.4 禁食和禁食后恢复采食对鹌鹑Leptin/LEPR表达的影响54-55
• 6.4 讨论55-56
• 6.5 小结56-58
• 7 全文总结58-60
• 参考文献60-69
• ABSTRACT69-71

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