脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗的制备及其免疫效果研究

发布时间：2017-10-21 00:25

  本文关键词：脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗的制备及其免疫效果研究

  更多相关文章： 鸭坦布苏病毒 E蛋白 脂质体疫苗 抗体 排毒情况 病毒血症

【摘要】：2010年3月,我国东南地区出现以种鸭、产蛋鸭严重产蛋下降为主要特征的急性传染病。随后,该病迅速蔓延至山东、安徽、福建、河南、河北等地,给我国的水禽养殖业带来巨大的经济损失。2010年10月,经过我国多个水禽岗位体系专家团队的共同努力,最终确定导致该病的病原为鸭坦布苏病毒。鸭群在感染鸭坦布苏病毒后主要临床症状为:精神沉郁,食欲下降,神经症状明显,死亡率达10-30%。主要剖解变化为:卵巢、脑膜、胰腺、气管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、等多个器官组织出血,尤其是卵泡出血、变性和破裂明显。免疫预防是控制坦布苏病毒感染的重要措施。由于TMUV分离株之间没有明显的变异,亦仅有一种血清型,因此,研制出有效、安全的疫苗进行该病的预防势在必行。本研究旨在通过制备脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗,并对其免疫效果进行研究,为我国的水禽养殖业提供一种切实有效的预防鸭坦布苏病毒的疫苗。首先,通过体外构建pet28a-E重组质粒,并将其转入Rosetta(DE3)菌株,使用终浓度为1m M的IPTG于37°C诱导表达5h得到重组E蛋白,并使用镍柱对表达的蛋白进行纯化,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)方法对表达的蛋白进行验证。E蛋白浓缩后浓度为2.2mg·m L-1。随后,使用逆相蒸发法将纯化的蛋白制备成脂质体疫苗,并使用鱼精蛋白法测定疫苗的包封率,以及对疫苗的生物安全性进行评价等。在制备脂质体疫苗时,卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1,加入一定量的维生素E可抗脂质氧化,之后对制备的疫苗进行安全性评价。脂质体疫苗包封率检测结果为52%,内毒素检测结果为2.3EU·mg-1,脂质过氧化性检测结果为0.12,以上指标均符合《中华药典》对疫苗的要求。最后,通过动物试验对疫苗的免疫效果进行评价,选用弗氏佐剂与脂质体佐剂进行比较。选用84只1日龄樱桃谷雏鸭进行免疫,分为7组:0组(对照组)、1组(脂质体1日龄免疫一次)、2组(脂质体1、7日龄免疫两次)、3组(脂质体7日龄免疫1次)、4组(弗氏佐剂1日龄免疫一次)、5组(弗氏佐剂1、7日龄免疫两次)、6组(弗氏佐剂7日龄免疫1次)。每7d采集一次血液检测血清中抗体水平,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)方法进行抗体检测,结果显示:2组(脂质体1、7日龄免疫两次)比其他组产生的抗体量更高,且抗体持续时间更久,抗体在第四周达到最高值,一直到实验结束后依然保持在阳性值以上。在疫苗免疫三周后对樱桃谷鸭进行攻毒实验,接种剂量为每只鸭1m L 102.4 TCID50,接毒后,每组随机挑选6只每天无菌采集一次血浆,用于病毒血症的检测,无菌采集雏鸭泄殖腔棉拭子及口咽棉拭子,检测病毒排放情况。病毒血症及病毒排毒量检测情况看,脂质体疫苗免疫两次组无病毒阳性检出,其他组均有不同程度的病毒阳性检出。通过抗体水平及病毒排放情况看,脂质体疫苗免疫两次组的免疫保护效果优于其他组。本研究为脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗应用于临床预防鸭坦布苏病毒病提供了切实有力的实验依据,对我国将来实现鸭坦布苏病毒的净化具有重要的意义。
【关键词】：鸭坦布苏病毒 E蛋白 脂质体疫苗 抗体 排毒情况 病毒血症
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-23
• 1.1 鸭坦布苏病毒的一般生物学特性11-14
• 1.1.1 分类11-12
• 1.1.2 形态结构12
• 1.1.3 基因组及编码蛋白12-13
• 1.1.4 理化特性和培养特性13-14
• 1.2 鸭坦布苏病毒病的流行病学研究14
• 1.3 鸭坦布苏病毒病的临床症状及病理变化14-15
• 1.3.1 临床症状14-15
• 1.3.2 病理变化15
• 1.4 鸭坦布苏病毒诊断方法研究进展15-17
• 1.4.1 临床诊断15
• 1.4.2 实验室诊断15-17
• 1.5 鸭坦布苏病毒感染的防制17-18
• 1.5.1 生物安全措施17-18
• 1.5.2 疫苗研究进展18
• 1.6 脂质体概述18-22
• 1.6.1 脂质体作为佐剂的优势19
• 1.6.2 脂质体疫苗的制备19-21
• 1.6.3 影响免疫效果的相关因素21
• 1.6.4 脂质体疫苗的安全性检测21-22
• 1.7 本研究的目的及意义22-23
• 1.8 创新点23
• 2 材料与方法23-35
• 2.1 试验材料23-26
• 2.1.1 主要试验材料23-24
• 2.1.2 主要试验仪器24
• 2.1.3 主要试验动物24
• 2.1.4 试验相关溶液的配制24-26
• 2.2 试验方法26-35
• 2.2.1 鸭坦布苏病毒E基因的克隆26-28
• 2.2.2 pet28a-E 重组表达载体的构建28-31
• 2.2.3 鸭坦布苏病毒E蛋白的制备31-33
• 2.2.4 脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗的制备33-34
• 2.2.5 脂质体疫苗免疫效果研究34-35
• 3 结果与分析35-41
• 3.1 鸭坦布苏病毒E基因的扩增35
• 3.2 E蛋白的纯化与验证35-36
• 3.3 蛋白浓度测定结果36
• 3.4 脂质体包被E蛋白疫苗的制备36-37
• 3.4.1 脂质体包封率的检测结果36
• 3.4.2 疫苗内毒素检测检验结果36-37
• 3.4.3 疫苗脂质过氧化性检测结果37
• 3.4.4 疫苗质量检验结果37
• 3.5 脂质体疫苗免疫效果37-41
• 3.5.1 血清中坦布苏病毒特异性抗体检测结果37-38
• 3.5.2 病毒血症及排毒检测结果38-41
• 4 讨论41-45
• 4.1 鸭坦布苏病毒病的流行状况41
• 4.2 脂质体相关疫苗研究成果41
• 4.3 脂质体E蛋白疫苗的质量检验41-42
• 4.4 脂质体疫苗免疫效果42-45
• 5 结论45-46
• 参考文献46-60
• 致谢60-62
• 攻读学位期间发表论文情况62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赵虹;谢芝勋;谢丽基;刘加波;邓显文;谢志勤;庞耀珊;范晴;罗思思;;H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立[J];中国畜牧兽医;2014年10期

2 陈又新;;樱桃谷种鸭坦布苏病的防治[J];上海畜牧兽医通讯;2014年05期

3 石迎;高旭元;余磊;李雪松;闫丽萍;滕巧泱;刘思当;李国新;李泽君;;不同代次鸭坦布苏病毒对蛋鸭的致病力研究[J];中国家禽;2014年06期

4 谢星星;李祥瑞;李银;赵冬敏;黄欣梅;韩凯凯;刘宇卓;游园;;检测坦布苏病毒病抗体NS1-ELISA方法的建立与初步应用[J];浙江农业学报;2014年01期

5 葛平萍;刁有祥;唐熠;刘鑫;高绪慧;于春梅;曲俊姿;;鸭坦布苏病毒山东株的分离鉴定及其特性[J];中国兽医学报;2014年01期

6 万春和;傅秋玲;陈珍;傅光华;施少华;程龙飞;陈红梅;黄瑜;;乳胶凝集试验方法在检测鸭坦布苏病毒抗体中的应用[J];福建农业学报;2013年12期

7 李云霞;刘晓丽;张s，

本文编号：1070235