重组高产H1N1亚型猪流感灭活疫苗的制备及免疫保护效力评价

发布时间：2017-10-22 04:28

  本文关键词：重组高产H1N1亚型猪流感灭活疫苗的制备及免疫保护效力评价

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【摘要】：猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属的分节段、负链RNA病毒,是引起猪呼吸道疾病的一种重要病原体。世界上猪群中流行的主要亚型为H1N1、H1N2和H3N2,其中欧洲禽源H1N1亚型和古典H1N1亚型SIV是国内主要的流行株。研究表明古典H1N1亚型SIV演化成为重组病毒并引发2009年人群中出现流感大流行,而在欧洲和亚洲也出现了关于欧洲禽源H1N1亚型SIV感染人的报道。因此防控SIV在猪群中传播具有重要意义,同样对指导和防控人及禽的流感病毒起到积极的辅助作用。本研究以国内流行的欧洲禽源H1N1亚型SIV(A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1),简称SH1)为试验材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并插入至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA、NA重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因重组质粒共转染293T细胞,成功拯救了重组欧亚禽源H1N1亚型SIV疫苗候选株(SH1/PR8)。MDCK细胞病毒生长曲线绘制结果表明,相对于原始毒株,重组病毒具有更高的病毒滴度:SH1/PR8以0.001MOI的剂量接种MDCK细胞48h后,病毒滴度最高且效价达到1×108TCID50/ml,血凝效价达到29,而原始毒株SH1的滴度为106TCID50/ml,血凝效价为27。病毒蚀斑试验结果也显示,重组病毒SH1/PR8形成的病毒蚀斑比原始毒株SH大,在MDCK细胞上具有更强的复制能力。前期本实验室以古典H1N1亚型SIV(A/swine/Guangdong/1/2011(H1N1)简称G11)为材料,成功构建了重组病毒G11/PR8,本研究MDCK细胞病毒生长曲线绘制结果显示,重组病毒G11/PR8的病毒滴度达到2×108TCID50,血凝效价达到210,相对于原始病毒G11同样具有更强的复制能力。将重组病毒SH1/PR8添加油乳佐剂制备成欧洲禽源H1N1亚型猪流感单价灭活疫苗,在小鼠和猪体内进行免疫保护效力的评价。小鼠体内抗体检测结果显示,免疫4周后HI抗体、中和抗体和IgG抗体效价持续升高,第4周达到最高的抗体效价。攻毒后小鼠体重变化和存活率试验结果表明,免疫组体重未明显下降且存活率为100%,而非免疫组小鼠体重持续下降至70%且攻毒6天后死亡率为100%。攻毒后肺脏组织病毒含量检测和病理学观察结果显示,免疫灭活疫苗能够有效抑制SH1病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。同样重组灭活疫苗免疫也能诱导猪体产生较高的抗体效价,通过检测攻毒后第5天猪鼻拭子、鼻甲骨和肺泡灌洗液中病毒的含量,结果显示免疫疫苗组都未检测到病毒肺脏的病变观察和组织病理检测也显示免疫灭活疫苗能显著降低病毒对猪肺脏的损伤。将重组病毒SH1/PR8和G11/PR8添加油乳佐剂制备成欧洲禽源和古典H1N1亚型猪流感二价灭活疫苗,在小鼠体内进行免疫保护效力评价,结果显示,二价重组灭活疫苗能诱导小鼠体内产生较高的针对欧洲禽源和古典H1N1亚型SIV的HI抗体、中和抗体和IgG抗体效价,能对两种病毒的攻击提供有效的免疫保护。单价疫苗能诱导机体产生高水平的针对同源病毒的抗体并产生良好免疫保护效果,但不能够抑制异源病毒在小鼠肺脏中复制,对异源病毒的攻击不能提供有效的免疫保护,小鼠体重持续下降,存活率为66.7%。以上结果表明,免疫二价灭活疫苗可针对欧亚禽源和古典H1N1亚型SIV攻击提供良好的免疫保护,而免疫单价灭活疫苗提供的交叉免疫保护作用较弱,只能提供部分的免疫保护。
【关键词】：猪流感病毒 H1N1亚型 重组灭活疫苗 交叉免疫保护
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 1 前言15-26
• 1.1 猪流感15-19
• 1.1.1 猪流感病毒形态结构15-16
• 1.1.2 猪流感病毒基因组结构和编码蛋白的功能16-17
• 1.1.3 猪流感病毒遗传演化17
• 1.1.4 古典H1N1亚型流感病毒17
• 1.1.5 禽源H1N1亚型流感病毒17-18
• 1.1.6 重组的H3N2、H1N2和H1N1亚型流感病毒18-19
• 1.2 猪流感疫苗概况19-24
• 1.2.1 灭活疫苗19-20
• 1.2.2 弱毒疫苗20-21
• 1.2.3 亚单位疫苗21-22
• 1.2.4 活载体疫苗22
• 1.2.5 核酸疫苗22-23
• 1.2.6 通用型疫苗23-24
• 1.3 培养制备流感疫苗概况24-26
• 1.3.1 鸡胚培养24
• 1.3.2 MDCK细胞培养24-25
• 1.3.3 Vero细胞培养25-26
• 2 材料与方法26-46
• 2.1 试验材料26-28
• 2.1.1 毒株和质粒26
• 2.1.2 细胞、菌种和鸡胚26
• 2.1.3 试验动物26
• 2.1.4 主要试剂26-27
• 2.1.5 主要仪器设备27
• 2.1.6 主要溶液试剂的配置27-28
• 2.2 试验方法28-46
• 2.2.1 重组质粒的构建28-32
• 2.2.1.1 引物的设计和合成28
• 2.2.1.2 病毒RNA的提取和cDNA合成28-29
• 2.2.1.3 病毒HA和NA基因的扩增29
• 2.2.1.4 扩增产物的回收、鉴定和纯化29-30
• 2.2.1.5 载体和HA、NA基因片段的酶切30-31
• 2.2.1.6 载体和HA、NA基因片段的连接31
• 2.2.1.7 目的基因和载体的转化31
• 2.2.1.8 重组质粒SH1/PR8的鉴定31-32
• 2.2.2 重组H1N1亚型猪流感病毒SH1/PR8的拯救32-34
• 2.2.2.1 重组质粒的提取32-33
• 2.2.2.2 重组质粒的转染33
• 2.2.2.3 重组病毒SH1/PR8的鉴定33-34
• 2.2.3 重组病毒SH1/PR8和原始病毒SH1在MDCK细胞上生长曲线的测定34-35
• 2.2.3.1 SH1/PR8和SH1的TCID50检测34-35
• 2.2.3.2 SH1/PR8和SH1的HA效价检测35
• 2.2.4 SH1/PR8和SH1在MDCK细胞上蚀斑的检测35-36
• 2.2.5 重组H1N1亚型SIV单价灭活疫苗的制备36
• 2.2.6 动物试验36-43
• 2.2.6.1 小鼠试验36-37
• 2.2.6.2 HI抗体效价检测37-38
• 2.2.6.3 血清中和抗体效价检测38
• 2.2.6.4 血清中特异性IgG抗体效价检测38-39
• 2.2.6.5 攻毒后第 3、5 天肺脏组织病毒含量检测及病理学观察39-40
• 2.2.6.6 攻毒后14天小鼠体重和存活率的变化40
• 2.2.6.7 猪试验40-41
• 2.2.6.8 血清中抗体的检测41-42
• 2.2.6.9 攻毒后第5天鼻拭子、鼻甲骨和肺泡灌洗液病毒含量检测42
• 2.2.6.10 攻毒后第5天猪肺脏组织病理学观察42-43
• 2.2.7 重组H1N1亚型SIV二价灭活疫苗的制备及免疫保护评价43-46
• 2.2.7.1 重组病毒G11/PR8和原始病毒G11生长曲线的测定43
• 2.2.7.2 G11/PR8和G11的TCID50检测43
• 2.2.7.3 G11/PR8和G11的HA效价检测43
• 2.2.7.4 重组H1N1亚型SIV二价灭活疫苗的制备43
• 2.2.7.5 小鼠试验43-44
• 2.2.7.6 HI抗体效价检测44-45
• 2.2.7.7 血清中和抗体效价检测45
• 2.2.7.8 血清中特异性IgG抗体效价检测45
• 2.2.7.9 攻毒后第 3、5 天肺脏组织病毒含量检测及病理学观察45
• 2.2.7.10 攻毒后14天小鼠体重和存活率的变化45-46
• 3 结果与分析46-68
• 3.1 重组质粒的构建46-47
• 3.1.1 原始病毒SH1的HA和NA基因扩增46
• 3.1.2 重组质粒PBD-HA和PBD-NA菌液PCR鉴定46-47
• 3.1.3 重组质粒的测序鉴定47
• 3.2 重组H1N1亚型猪流感病毒SH1/PR8的拯救47
• 3.3 拯救的重组H1N1亚型猪流感病毒SH1/PR8的鉴定47-48
• 3.4 SH1/PR8和在MDCK细胞上的生长曲线48-49
• 3.4.1 SH1/PR8和SH1的TCID50检测48
• 3.4.2 SH1/PR8和SH1的HA效价检测48-49
• 3.5 SH1/PR8和SH1在MDCK细胞上蚀斑的大小49-50
• 3.6 重组H1N1亚型SIV单价灭活疫苗的保护效力评价50-59
• 3.6.1 小鼠试验结果50
• 3.6.2 HI抗体效价50-51
• 3.6.3 血清中和抗体效价51
• 3.6.4 血清中特异性IgG抗体效价51-52
• 3.6.5 攻毒后第 3、5 天小鼠肺脏组织病毒含量52-53
• 3.6.6 攻毒后第5天肺脏组织病理学的变化53-54
• 3.6.7 攻毒后14天小鼠体重的变化54
• 3.6.8 攻毒后14天小鼠存活率的变化54-55
• 3.6.9 猪试验结果55
• 3.6.10 猪血清中的抗体的效价55-57
• 3.6.11 攻毒后第5天猪鼻试子、鼻甲骨和肺泡灌洗液病毒的含量57-58
• 3.6.12 攻毒后第5天猪肺脏病变观察58-59
• 3.7 重组H1N1亚型SIV二价灭活疫苗的制备及保护效力评价59-68
• 3.7.1 重组病毒G11/PR8和原始病毒G11在MDCK细胞上的生长曲线59-60
• 3.7.2 小鼠试验结果60
• 3.7.3 HI抗体效价60-61
• 3.7.4 血清中和抗体效价61-62
• 3.7.5 血清中特异性IgG抗体效价62-63
• 3.7.6 攻毒后第 3、5 天肺脏组织病毒的含量63-64
• 3.7.7 攻毒后第5天肺脏组织病理学变化64-66
• 3.7.8 毒后14天小鼠体重的变化66-67
• 3.7.9 攻毒后14天小鼠存活率的变化67-68
• 4 讨论68-70
• 5 结论70-71
• 参考文献71-80
• 致谢80-81
• 攻读硕士学位期间发表的论文81

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