ESD蛋白增强Ⅰ型干扰素信号转导抑制口蹄疫病毒的复制

发布时间：2017-10-22 06:02

  本文关键词：ESD蛋白增强Ⅰ型干扰素信号转导抑制口蹄疫病毒的复制

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【摘要】：口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染PK-15细胞后,其复制产生的正链RNA能够被细胞质中的模式识别受体MDA5识别。MDA5招募下游接头蛋白VISA,VISA不仅能够与TRAF6相互作用,通过IKK复合物磷酸化修饰I?B?,使其与NF-?B分离后被降解,NF-?B转移到细胞核中;VISA而且能够招募MITA,与蛋白激酶TBK1相互作用,从而磷酸化修饰IRF3,磷酸化的IRF3通过形成二聚体,从而转移到细胞核中。进入细胞核的NF-?B和IRF3诱导细胞中I型干扰素(IFNs)和多种ISGs等抗病毒因子的转录和表达,引起抗病毒天然免疫反应。ESD的酶活性与很多疾病的发生密切相关,然而,ESD参与调控天然免疫信号转导,发挥抗病毒作用的机制目前还没有相关报道。课题组前期转录组分析数据结果表明,FMDV感染PK-15细胞后,ESD的转录水平出现显著上调,表明ESD与FMDV的感染存在一定关联。在本研究中,我们通过病毒感染实验发现,随着FMDV在PK-15细胞中感染时间的延伸,ESD的转录水平和蛋白水平均显著上调。我们进一步扩增了猪的ESD基因,构建了猪ESD基因的真核表达质粒。在PK-15细胞中过表达ESD蛋白后接种FMDV,发现FMDV的复制水平显著下降,且呈剂量依赖性。同时借助siRNA干扰技术,下调表达PK-15细胞中的内源性ESD蛋白,然后接种FMDV,发现FMDV的复制水平显著上升。通过过表达和干扰实验,我们证实了ESD能够抑制FMDV的复制。为了进一步探究ESD抑制FMDV复制的分子机制,我们检测了病毒感染过程中ESD蛋白对I型干扰素信号通路下游多个抗病毒干扰素刺激基因(ISGs)表达的影响,结果表明:过表达或下调表达ESD,FMDV诱导的ISG15,MX1,ISG54,RIG-I,PKR和GBP1的mRNA表达水平也呈相应的上调或下调变化。为探究ESD是否能够调控I型干扰素信号转导,我们开展了IFN-β启动子荧光素酶报告实验,结果发现ESD能够促进SeV诱导的IFN-β的激活,并呈剂量依赖性。为进一步揭示ESD如何调控I型干扰素信号转导,我们开展了I型干扰素通路分子过表达激活IFN-β启动子荧光素酶报告系统实验,结果表明ESD能够提高IRF3以及它的上游信号分子(RIG-I-CARD,MDA5,VISA和TBK1)诱导的IFN-β的激活,但不影响IRF7诱导的IFN-β的激活,因此,我们推测ESD可能通过靶向IRF3来增强I型干扰素信号转导。为证实ESD是否影响IRF3介导的信号转导,我们又从蛋白水平上分别检测了MDA5,VISA,TBK1,p-TBK1,IRF3,p-IRF3和病毒蛋白表达变化,结果表明:过表达ESD后,VISA,TBK1和IRF3表达水平变化不明显,p-IRF3表达水平升高,FMDV复制水平下降;下调表达ESD后,VISA,TBK1和IRF3表达水平变化不明显,p-IRF3表达水平减少,FMDV复制水平上升。这些结果表明ESD蛋白通过增强IRF3的磷酸化水平来促进I型干扰素信号转导,从而发挥抗病毒作用。总之,通过本研究的开展,我们首次揭示了ESD蛋白能够发挥抗病毒作用。证实了ESD蛋白能够增强IRF3的磷酸化水平,促进FMDV诱导的I型干扰素信号通路的活化,诱导多种ISGs的转录和表达,从而抑制FMDV在PK-15细胞中的复制。
【关键词】：口蹄疫病毒 酯酶D 干扰素相关因子 干扰素刺激基因 抗病毒应答反应
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 口蹄疫概述11-13
• 1.2 天然免疫概述13-16
• 1.3 口蹄疫病毒与天然免疫关系的研究16
• 1.4 ESD蛋白的研究进展16-17
• 1.5 研究目的及意义17-18
• 第二章 猪ESD基因的扩增及其与FMDV复制关系的研究18-33
• 2.1 前言18
• 2.2 材料18-20
• 2.2.1 质粒，毒株，细胞系及抗体18
• 2.2.2 试剂及溶液配制18-20
• 2.2.3 试验器材20
• 2.3 方法20-26
• 2.3.1 质粒的构建20-23
• 2.3.2 细胞的转染和接毒23-24
• 2.3.3 siRNA干扰技术24
• 2.3.4 FMDV滴度的测定24-25
• 2.3.5 Western blotting检测25-26
• 2.3.6 实时荧光定量PCR（SYBR? Green法）检测26
• 2.3.7 数据分析26
• 2.4 结果26-31
• 2.4.1 Myc-ESD重组质粒的构建及其验证表达26-28
• 2.4.2 ESD siRNA干扰效果28
• 2.4.3 ESD在口蹄疫病毒复制中上调表达28-29
• 2.4.4 过表达ESD显著抑制FMDV在PK-15细胞中的复制29-30
• 2.4.5 下调表达ESD显著促进FMDV在PK-15细胞中的复制30-31
• 2.5 讨论31-33
• 第三章 ESD抑制FMDV复制的分子机制研究33-43
• 3.1 前言33
• 3.2 材料33-34
• 3.2.1 质粒，毒株，，细胞系及抗体33
• 3.2.2 试剂及溶液配制33-34
• 3.2.3 试验器材34
• 3.3 方法34-35
• 3.3.1 实时荧光定量PCR（SYBR? Green法）检测34-35
• 3.3.2 双荧光素酶报告系统检测35
• 3.3.3 其他试验方法检测35
• 3.3.4 数据分析35
• 3.4 结果35-41
• 3.4.1 ESD调控FMDV诱导的ISGs的表达35-38
• 3.4.2 ESD正调控SeV诱导的IFN-β的活化38
• 3.4.3 ESD通过靶向IRF3来增强IFN-β的活化38-39
• 3.4.4 ESD通过调控IRF3的磷酸化水平来影响FMDV的复制39-41
• 3.5 讨论41-43
• 第四章 全文结论43-44
• 参考文献44-50
• 致谢50-51
• 作者简历51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孙辉;蒋争凡;;抗病毒天然免疫研究[J];中国科学:生命科学;2013年10期

本文编号：1077025