以CotB为分子载体表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草杆菌重组芽孢的研究

发布时间：2017-10-22 08:33

  本文关键词：以CotB为分子载体表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草杆菌重组芽孢的研究

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【摘要】：本研究将猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白COE1保护性抗原片段与枯草杆菌芽孢衣壳蛋白CotB基因进行融合,通过同源双交叉构建表面展示S蛋白COE1保护性抗原片段的枯草杆菌重组芽孢。以小鼠为动物模型,通过灌胃及拌料方式给予重组芽孢,观察重组芽孢对小鼠的免疫反应及部分微生态益生效应,以期依靠枯草杆菌天然的益生作用结合PEDV保护性抗原表位刺激的特异性黏膜免疫反应,用于预防猪流性型腹泻病以降低其对畜牧业带来的影响。试验内容与结果如下：(1)本试验参考PEDV S蛋白抗原表位现有研究,选择PEDV S基因的保护性抗原片段(COE1),通过枯草杆菌穿梭整合质粒pDG364分别将目的片段CotB、COE1依次连接到质粒pDG364多克隆位点,构建重组质粒pDG364-CotB-COE,。对重组质粒分别进行PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明CotB、COE1基因片段成功地载入质粒pDG364多克隆位点,成功构建重组质粒pDG364-CotB-COE1。(2)重组质粒pDG364与枯草杆菌染色体通过同源双交叉,使得CotB-COE1重组于枯草杆菌染色体,构建重组枯草芽孢杆菌(PBE)。通过淀粉酶活性分析与PCR鉴定,结果表明CotB-COE1融合基序成功整合于枯草杆菌染色体；Western-blot分析结果在67.78kDa处获得一条特异性蛋白条带,表明融合基序CotB-COE1获得了表达；使用生物素标记抗体进行免疫荧光显微镜观察,重组芽孢具有特异性荧光信号,结果表明PEDVS蛋白的COE1保护性抗原片段成功地在枯草杆菌芽孢表面获得表达。(3)选用ICR雌性小鼠120只,随机平均分成5组,即枯草杆菌重组芽孢灌胃组(gb)、枯草杆菌重组芽孢拌料组(bb)、野生型枯草杆菌168芽孢灌胃组(g1)、野生型枯草杆菌168芽孢拌料组(b1)、PBS对照组(K)。g1与gb组小鼠每次每只灌服芽孢悬液100μ1(芽孢量为1.0×1010CFU); b1与bb组则以拌料饲喂的方式给予小鼠芽孢,饲料含芽孢量为1.0×106CFU/g; K组为PBS对照组,仅饲喂基础日粮。采集血液、小肠内容物,测定血清中抗PEDV特异性IgG抗体水平及小肠内容物中sIgA抗体水平。结果表明,重组芽孢灌胃或拌料组小鼠血清及小肠内容物中均检测到PEDV特异性抗体,且各组在21d后可检测到明显的抗体水平,第35d抗体水平达到最高峰,至49天仍能检测到较高水平的抗体：重组芽孢灌胃或拌料组与野生型芽孢灌胃或拌料组、对照组抗体水平相比,差异极显著(P0.01);另重组芽孢拌料组所诱导的血清IgG与肠粘膜sIgA抗体水平均高于灌胃组,但差异不显著(P0.05)。(4)采用MTT法检测脾细胞增殖及采用ELISA检测IL-4、IFN-γ分泌情况。结果,各组间小鼠脾细胞增殖刺激指数(SI)差异不显著(P0.05)：重组芽孢灌胃组IL-4和IFN-γ水平极显著高于野生型芽孢灌胃组、对照组(P0.01)；重组芽孢拌料组IL-4和IFN-γ水平极显著高于野生型芽孢拌料组和PBS对照组(P0.01),重组芽孢拌料组IL-4水平极显著高于重组芽孢灌胃组(P0.01),但重组芽孢灌胃组所分泌IFN-γ水平则略高于重组芽孢拌料组(P0.05)。(5)对试验49d小鼠盲肠内容物进行活菌计数及PCR-DGGE分析。结果表明,枯草杆菌重组芽孢灌胃或拌料组较对照组增重显著(p0.05),其中灌胃组增重略低于拌料组,但各组间差异不显著(p0.05);对照组盲肠内容物中大肠杆菌数量较其它组高,灌胃、拌料重组与非重组芽孢组盲肠内容物中乳酸杆菌数量则明显高于对照组；PCR-DGGE分析显示饲喂枯草杆菌芽孢组小鼠盲肠内菌群数量和密度均得到增加。各组间胸腺指数差异不显著(p0.05),重组芽孢组小鼠脾脏指数极显著高于野生型芽孢组、对照组(p0.01)；综上所述,本试验成功地将猪流行性腹泻病毒的S蛋白保护性抗原片段COE1整合于枯草芽孢杆菌基因组。经免疫荧光显微镜观察及Western-Blot鉴定枯草杆菌重组芽孢具有较好的免疫原性。动物试验结果表明枯草杆菌重组芽孢可诱导小鼠产生一定水平的抗猪流行性腹泻病毒的体液免疫反应和细胞免疫反应。另枯草杆菌重组芽孢能促进小鼠生长,提高盲肠优势菌群数量,增加肠道菌群结构的多样性、丰度和菌群的稳定性,提高脾脏指数。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 枯草芽孢杆菌 芽孢表面展示 免疫 微生态学
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略语表9-13
• 第一章 文献综述13-18
• 1 猪流行性腹泻病毒及其疫苗的研究13-15
• 1.1 猪流行性腹泻的流行与危害13
• 1.2 猪流行性腹泻病毒的研究13-14
• 1.3 猪流行性腹泻病毒抗原表位的研究14
• 1.4 猪流行性腹泻病毒疫苗的研究14-15
• 2 枯草杆菌芽孢表面展示技术15-17
• 2.1 枯草杆菌芽孢15-16
• 2.2 枯草杆菌芽孢作为疫苗载体的研究16-17
• 3 本研究的选题意义17-18
• 第二章 构建表面展示PEDV S蛋白保护性抗原片段的枯草杆菌重组芽孢18-34
• 1 材料18-20
• 1.1 病毒18
• 1.2 菌株及质粒18
• 1.3 试剂及溶液18-19
• 1.4 培养基19-20
• 1.5 试验仪器20
• 2 方法20-27
• 2.1 目的片段的扩增20-22
• 2.1.1 引物设计20-21
• 2.1.2 基因组提取21
• 2.1.3 PCR扩增目的片段21-22
• 2.2 重组质粒pDG364-CotB-COE_1的构建22-24
• 2.2.1 目的片段与T载体的连接22
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备22
• 2.2.3 连接产物的转化22-23
• 2.2.4 重组质粒pDG364-CotB-COE_1的构建23-24
• 2.3 重组枯草芽孢杆菌的构建24
• 2.3.1 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备24
• 2.3.2 重组质粒pDG364-CotB-COE1的转化24
• 2.4 重组枯草芽孢杆菌的鉴定筛选24-25
• 2.4.1 重组枯草芽孢杆菌的淀粉酶活性鉴定24
• 2.4.2 重组枯草芽孢杆菌PCR及测序鉴定24-25
• 2.5 枯草杆菌重组芽孢的鉴定与观察25-27
• 2.5.1 枯草杆菌芽孢的制备25
• 2.5.2 枯草芽孢杆菌芽孢的纯化25
• 2.5.3 枯草杆菌重组芽孢衣壳总蛋白western-blot分析25-26
• 2.5.4 枯草杆菌重组芽孢免疫显微镜观察26-27
• 3. 试验结果27-32
• 3.1 目的基因的扩增27-28
• 3.2 重组质粒pDG364-CotB-COE1的鉴定28-29
• 3.3 重组枯草芽孢杆菌淀粉酶活性鉴定29
• 3.4 重组枯草芽孢杆菌PCR鉴定29-31
• 3.5 重组芽孢Western-blot及免疫荧光显微镜分析31-32
• 4 讨论32-34
• 第三章 表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草杆菌重组芽孢对小鼠免疫效果研究34-42
• 1 材料34
• 1.1 病毒与菌株34
• 1.2 试剂与溶液34
• 1.2.1 试剂34
• 1.2.2 ELISA检测所需溶液的配制34
• 1.3 培养基34
• 2 方法34-37
• 2.2 动物饲养管理34-35
• 2.3 动物分组35
• 2.4 样品的采集35
• 2.5 血清IgG与肠内容物sIgA抗体水平间接ELISA检测35-36
• 2.6 脾淋巴细胞增殖36-37
• 2.6.1 小鼠淋巴细胞的制备36
• 2.6.2 淋巴细胞增殖试验36-37
• 2.7 淋巴细胞因子检测37
• 2.8 数据统计37
• 3. 结果37-40
• 3.1 间接ELISA抗体水平检测37-38
• 3.1.1 血清特异性IgG抗体水平检测结果37-38
• 3.1.2 小鼠小肠内容物中特异性sIgA检测结果38
• 3.2 淋巴细胞增殖试验38-39
• 3.3 淋巴细胞因子测定结果39-40
• 4. 讨论40-42
• 第四章 重组枯草杆菌PBE芽孢对小鼠生长、盲肠菌群及免疫器官指数的影响42-50
• 1 材料42
• 1.1 试剂及仪器42
• 1.2 培养基42
• 2 方法42-44
• 2.1 小鼠生长性能测定42-43
• 2.2 小鼠盲肠菌群的活菌计数43
• 2.2.1 盲肠内容物样品处理43
• 2.2.2 培养与计数43
• 2.3 PCR-DGGE检测小鼠盲肠菌群结构变化43-44
• 2.3.1 细菌总DNA提取43
• 2.3.2 基因组总DNA16S rDNA V3区扩增43
• 2.3.3 扩增片段的变性梯度凝胶电泳43-44
• 2.3.4 条带的回收及克隆测序44
• 2.4 免疫器官指数检测44
• 2.5 数据统计44
• 3 结果与分析44-48
• 3.1 重组芽孢对小鼠增重的影响44-45
• 3.2 小鼠盲肠菌群数量变化45
• 3.3 小鼠肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱45-46
• 3.4 PCR-DGGE检测小鼠肠道菌群多样性46-47
• 3.5 小鼠肠道特异性菌群和共性菌群分析47
• 3.6 重组芽孢对小鼠免疫器官的影响47-48
• 4 讨论48-50
• 第五章 结论50-51
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 附录58-63
• 在读期间发表的学术论文63

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