泰山松花粉多糖对重组PRRSV GP5蛋白免疫增强作用的研究

发布时间：2017-10-22 16:12

  本文关键词：泰山松花粉多糖对重组PRRSV GP5蛋白免疫增强作用的研究

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种高度接触性的病毒性疾病,发病率高,死亡率也高,最易感动物是妊娠母猪和1月龄内的仔猪,主要引起猪的呼吸困难和繁殖障碍性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。现阶段使用的PRRSV商品化疫苗主要是减毒活疫苗和灭活苗。常用的PRRSV减毒活疫苗存在加速PRRSV毒株变异的风险,而灭活疫苗仅能诱导极其有限的保护性免疫反应。PRRSV亚单位疫苗是PRRS免疫预防的一个重要研发方向,但是亚单位疫苗通常免疫原性较低,因此,筛选针对PRRSV亚单位疫苗的高效免疫佐剂是提高现有亚单位疫苗免疫效力的重要途径。本研究以原核表达的高致病性PRRSV囊膜糖蛋白5(GP5)为免疫原,不同剂量的泰山松花粉多糖(Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharides,TPPPS)作为免疫佐剂,以评定TPPPS对GP5蛋白诱导免疫应答的免疫增强作用。本研究主要包含以下两个部分:1、PRRSV GP5重组质粒鉴定与蛋白表达:将重组质粒p ET-32a-GP5用PCR、双酶切进行鉴定并测序,验证正确的重组质粒p ET-32a-GP5转化至BL21(DE3)p Lys S感受态细胞中,进行原核蛋白的表达。将表达的蛋白SDS-PAGE分析得到大小约为32 KD的目的条带。同时,Western-Blot鉴定,结果可清晰看见约32 KD大小的特异性印迹,与SDS-PAGE分析的结果相一致。然后,将获得的蛋白通过His标签镍层析柱进行纯化。2、泰山松花粉多糖对重组PRRSV GP5蛋白的免疫增强作用:本研究选取72只SPF昆明小鼠,随机分为6组(Ⅰ-Ⅵ)。Ⅰ组注射纯化的GP5蛋白,Ⅱ-Ⅳ组分别注射不同浓度的TPPPS(20、40、60 mg/m L)佐剂+GP5蛋白,Ⅴ组注射弗氏佐剂+GP5蛋白,Ⅵ组注射PBS;1周后加强免疫1次。每周随机挑选3只小鼠采其外周血,用ELISA检测其抗GP5抗体效价,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的比例,用MTT比色法检测T淋巴细胞转化率,以ELISA试剂盒分别检测IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子浓度。结果表明,所有疫苗免疫组小鼠的以上免疫指标均有显著提高,而添加TPPPS和弗氏佐组的各项指标均显著高于单独GP5蛋白接种组。3个浓度的TPPPS佐剂中,60mg/m L TPPPS的免疫增强效果最好。本研究表明,PRRSV GP5蛋白诱导了特异性免疫应答反应,TPPPS佐剂对GP5蛋白具有理想的免疫增强作用。这为PRRSV GP5蛋白亚单位疫苗的研制提供了理论依据和技术依托。
【关键词】：泰山松花粉多糖 免疫增强作用 猪繁殖与呼吸综合征病毒 囊膜糖蛋白5 亚单位疫苗
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 符号说明5-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1.前言14-22
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征14-17
• 1.1.1 PRRSV生物学特性14-15
• 1.1.2 PRRSV分子生物学研究15
• 1.1.2.1 PRRSV基因结构15
• 1.1.2.2 PRRSV编码的蛋白15
• 1.1.3 PRRS流行现状15-16
• 1.1.4 PRRS致病机理16
• 1.1.5 临床症状及病理变化16-17
• 1.1.6 诊断和防制17
• 1.2 疫苗的发展现状17-18
• 1.2.1 传统疫苗17-18
• 1.2.1.1 PRRSV灭活苗18
• 1.2.1.2 PRRSV减毒活疫苗18
• 1.3 疫苗佐剂的研究现状18-21
• 1.3.1 不溶性铝盐类佐剂19
• 1.3.2 油乳佐剂19-20
• 1.3.3 表面活性剂类佐剂20
• 1.3.4 细菌微生物类佐剂20
• 1.3.5 中药类佐剂20-21
• 1.3.6 多糖佐剂21
• 1.4 松花粉多糖的研究进展21
• 1.5 本研究的目的与意义21-22
• 2. 材料与方法22-36
• 2.1 重组质粒pET-32a-GP5的鉴定与蛋白的表达22-29
• 2.1.1 试剂与仪器22-23
• 2.1.2 试剂和培养基的配制23-24
• 2.1.3 重组质粒pET-32a-GP5的鉴定24-27
• 2.1.3.1 重组质粒pET-32a-GP5的转化24-25
• 2.1.3.2 PCR的鉴定25-26
• 2.1.3.3 双酶切的鉴定26-27
• 2.1.4 重组PRRSV GP5蛋白的表达与纯化27-29
• 2.1.4.1 重组PRRSV GP5蛋白的诱导表达27-28
• 2.1.4.2 蛋白的制备与纯化28-29
• 2.2 泰山松花粉多糖对PRRSV GP5蛋白的免疫增强作用29-36
• 2.2.1 主要试剂与仪器29
• 2.2.2 主要试剂的配制29-30
• 2.2.3 亚单位疫苗及免疫佐剂制备30
• 2.2.4 动物试验及免疫程序30
• 2.2.5 松花粉多糖对小鼠体液免疫测定30-34
• 2.2.5.1 血清抗体效价的检测30-31
• 2.2.5.2 PRRSV特异性中和抗体检测31-33
• 2.2.5.3 血清中IL-4 的含量检测33-34
• 2.2.6 松花粉多糖对小鼠细胞免疫的影响34-35
• 2.2.6.1 血清中IFN-γ和IL-2 的含量检测34
• 2.2.6.2 外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞数量的测定34-35
• 2.2.6.3 外周血T淋巴细胞增殖35
• 2.2.7 数据分析35-36
• 3. 结果36-44
• 3.1 重组质粒pET-32a-GP5的鉴定与蛋白表达36-38
• 3.1.1 重组质粒pET-32a-GP5的鉴定36-37
• 3.1.2 重组PRRSV GP5蛋白的表达37-38
• 3.2 松花粉多糖对小鼠体液免疫的影响38-40
• 3.2.1 血清抗体效价38-39
• 3.2.2 免疫血清对PRRSV的中和作用39
• 3.2.3 血清中IL-4 含量的变化39-40
• 3.3 松花粉多糖对小鼠细胞免疫的影响40-44
• 3.3.1 血清中IFN-γ含量的变化40-41
• 3.3.2 血清中IL-2 含量的变化41
• 3.3.3 外周血CD4+ T淋巴细胞百分含量41-42
• 3.3.4 外周血CD8+ T淋巴细胞百分含量42-43
• 3.3.5 外周T淋巴细胞转化率43-44
• 4. 讨论44-46
• 5. 结论46-47
• 参考文献47-52
• 致谢52-53
• 个人简介53-54
• 攻读硕士学位期间发表论文情况54

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