牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因筛选及初步分析

发布时间：2017-10-23 04:02

  本文关键词：牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因筛选及初步分析

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【摘要】：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)常引起牛出血性败血症、牛肺炎、禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、山羊和绵羊肺炎等多种动物疾病,人类受到携带病原的动物咬伤或者抓伤也会引发感染。多杀性巴氏杆菌根据荚膜血清型的不同分为A、B、D、E和F 5种血清群,根据脂多糖抗原的不同分为16种血清型。自2008年我国首次分离到牛源A型多杀性巴氏杆菌以来,该病原常与其他病原菌继发感染,在多地牛群中呈现流行性发生,感染该病菌的牛出现高发病率和死亡率,对养牛业造成重大的经济损失。多杀性巴氏杆菌根据其对宿主致病力的不同,分为强毒力菌株和弱毒力菌株,影响菌株毒力的主要因素是编码毒力因子的毒力基因以及相关调控基因,强弱毒株基因组序列的比较可为菌株致病性研究提供许多有用信息,强毒株中存在,弱毒株中不存在的差异基因往往在细菌致病机理中占有重要作用。研究表明,毒力基因表达的蛋白作为抗原制备疫苗免疫动物,可以对机体起到免疫保护作用。抑制性消减杂交技术(SSH)是目前应用成熟的一种技术,常用于致病菌与非致病菌差异基因筛选,将其基因组共同的部分去除,提炼更有价值的信息。本研究通过SSH技术对强毒株PmCQ2和弱毒株PmCQ6基因组进行消减杂交,试图获得可能具有致病性或调控毒力基因表达的候选基因序列片段;然后结合对强弱毒株差异基因的生物信息学分析结果,筛选可能的差异基因候选分子,通过PCR扩增验证并进一步比对分析;最后对差异基因克隆表达,选择蛋白表达量高且反应原性好的分子做初步研究。具体内容及结果如下:1、牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选以本实验室保存的牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株PmCQ2和弱毒株PmCQ6为研究对象,利用抑制性消减杂交技术研究强弱毒株差异基因。结果表明:pmcq2和pmcq6基因组dna酶切完全,通过消减杂交富集了差异基因片段,成功构建差减文库并对其基因进行t克隆,菌液pcr结果显示117个阳性克隆获得了插入片断,测序和基因生物信息学分析后获得28个差异基因,将差异基因按照编码的蛋白功能不同分为五类:毒力因子相关蛋白、代谢相关蛋白、转录相关蛋白、dna合成相关蛋白、其他相关蛋白。研究结果为牛源a型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的筛选以及致病性基因的深入探讨奠定了分子基础。2、牛源a型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的生物信息学分析及pcr验证ssh法分析获得的强弱毒株28个差异基因片段与牛源a型多杀性巴氏杆菌pmcq2株和pmcq6株的全基因组序列本地数据库进行比对,得到1个只存在于pmcq2基因组的差异基因pmcq2-6g0023,编码噬菌体尾巴蛋白,与弱毒株的对应基因pmcq6-8g0001序列相比,pmcq2-6g0023基因缺失了30个碱基。根据公司对强弱毒株基因组生物信息学分析结果,从理论上得到46个差异基因,这些基因数量多且差异性还待进一步验证。前期研究表明噬菌体相关基因在巴氏杆菌中常成簇存在,并且会影响菌株的致病力,推测pmcq2-6g0023的上下游基因以及与噬菌体相关的其他基因也存在差异性。本试验基于以上的研究和推测,参照公司分析得到的46个差异基因,从中筛选了7个噬菌体相关基因、1个pmcq2-6g0023上游基因pmcq2_6g0019、1个可能编码毒力因子gp63或假定蛋白的基因pmcq2_6g0001等共9个基因,还有pmcq2-6g0023,分别进行pcr扩增,验证其在强弱毒株中的差异性。结果表明,本实验室分离保存的强毒株pmcq2、pmcq1、pmcq3、pmcq4、pmcq5以及pmcq7与弱毒株pmcq6的差异基因共8个,分别是pmcq2_2g0233、pmcq2_2g0235、pmcq2_5g0023、pmcq2_6g0001、pmcq2_6g0006、pmcq2_6g0018、pmcq2_6g0019、pmcq2_6g0021。pmcq2-6g0023也可以从其他5个强毒株中扩增得到。差异基因中编码的蛋白注释结果有7个与噬菌体相关(包括pmcq2-6g0023),证明了推测的正确性。3、牛源a型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因pmcq2-6g0018的表达及其免疫保护性研究选取以上研究获得的9个差异基因以及pmcq6-8g0001,通过pcr克隆差异基因全长,分别插入原核表达载体pet-30a(+),经iptg诱导表达重组蛋白,sds-page分析结果表明,4个重组目标蛋白在大肠杆菌中实现表达且与预期分子大小一致。选择其中蛋白注释功能为噬菌体尾巴蛋白,且表达量高的rPmCQ2-6g0018和rPm CQ2-6g0021重组蛋白,大量诱导表达后,用Ni柱对目标融合蛋白进行纯化,经Western-blot分析发现,重组蛋白rPmCQ2-6g0018分子量大小约19 KDa且具有良好的免疫活性。从转录水平分析基因PmCQ2-6g0018在体内的表达情况,结果显示,在16h时间点,PmCQ2-6g0018在小鼠肺脏中相对表达量极显著高于对照组。将纯化蛋白rPmCQ2-6g0018和全菌蛋白分别免疫小鼠(免疫剂量为100μg/只),二免后2周收集抗血清,ELISA法检测抗体水平,用2LD50 PmCQ2株(4.4í105cfu)对小鼠进行腹腔攻毒保护性试验。结果显示,rPmCQ2-6g0018蛋白免疫组抗体水平稍低于全菌蛋白免疫组,rPmCQ2-6g0018蛋白的免疫保护率为25%,全菌蛋白免疫保护率为100%。PmCQ2基因组中噬菌体尾巴蛋白相关基因的研究为牛源A型多杀性巴氏杆菌致病机制的深入探讨提供了参考。
【关键词】：牛 多杀性巴氏杆菌 抑制性消减杂交 差异基因
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 第1章 文献综述13-23
• 1.1 多杀性巴氏杆菌概述13-15
• 1.1.1 多杀性巴氏杆菌病原学和分类13-14
• 1.1.2 多杀性巴氏杆菌主要流行病学14
• 1.1.3 多杀性巴氏杆菌的致病机制14-15
• 1.2 多杀性巴氏杆菌毒力因子基因研究进展15-19
• 1.2.1 多杀性巴氏杆菌毒素相关基因15-16
• 1.2.2 铁调节和铁捕获蛋白相关基因16-17
• 1.2.3 荚膜相关基因17
• 1.2.4 脂多糖相关基因17-18
• 1.2.5 外膜蛋白相关基因18-19
• 1.3 噬菌体对细菌致病性的影响研究概况19-20
• 1.4 抑制性消减杂交技术在寻找新的致病性基因中的应用20-23
• 第2章 引言23-25
• 2.1 研究目的与意义23
• 2.2 主要内容23-24
• 2.3 技术路线24-25
• 第3章 牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选25-41
• 3.1 材料25-27
• 3.1.1 菌种25
• 3.1.2 试剂25
• 3.1.3 主要化学试剂的配制25-26
• 3.1.4 主要仪器26-27
• 3.2 方法27-35
• 3.2.1 差减文库的构建27-33
• 3.2.2 差减文库的克隆33-34
• 3.2.3 菌液PCR筛选34-35
• 3.2.4 测序与同源性分析35
• 3.3 结果35-39
• 3.3.1 差减文库的构建35-38
• 3.3.2 差减文库的克隆及PCR鉴定38
• 3.3.3 测序与同源性分析38-39
• 3.4 讨论39-41
• 第4章 牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的生物信息学分析及PCR验证41-49
• 4.1 材料41
• 4.1.1 菌种41
• 4.1.2 试剂41
• 4.1.3 生物信息分析软件41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 SSH法筛选得到的28个差异基因生物信息学分析41-42
• 4.2.2 差异基因的进一步筛选42
• 4.2.3 差异基因的PCR验证42-43
• 4.3 结果43-46
• 4.3.1 SSH法筛选得到的28个差异基因生物信息学分析43
• 4.3.2 差异基因的进一步筛选结果43
• 4.3.3 差异基因的PCR验证43-46
• 4.4 讨论46-49
• 第5章 牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因PmCQ2-6g0018的表达及其免疫保护性研究49-65
• 5.1 材料49-51
• 5.1.1 菌种及实验动物49
• 5.1.2 试剂49
• 5.1.3 主要化学试剂配制49-51
• 5.1.4 主要仪器和生物信息学分析软件51
• 5.2 方法51-58
• 5.2.1 差异基因的克隆表达及其表达产物的免疫学活性分析51-56
• 5.2.2 PmCQ2_6g0018基因体内表达情况的分析56-57
• 5.2.3 动物保护性试验57-58
• 5.3 结果58-63
• 5.3.1 差异基因的克隆表达及其表达产物的免疫学活性分析58-61
• 5.3.2 PmCQ2_6g0018基因体内表达情况的分析结果61-62
• 5.3.3 ELISA检测抗体水平62-63
• 5.3.4 动物保护性试验结果63
• 5.4 讨论63-65
• 第6章 结论65-67
• 6.1 牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选65
• 6.2 牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的生物信息学分析及PCR验证65
• 6.3 牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因PmCQ2_6g0018的表达及其免疫保护性研究65-67
• 参考文献67-73
• 附录73-77
• 致谢77-79
• 攻读硕士期间发表论文及参加科研项目79

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