抗犬瘟热病毒单域抗体库的构建与犬瘟热基因原核表达质粒的构建

发布时间：2017-10-23 19:26

  本文关键词：抗犬瘟热病毒单域抗体库的构建与犬瘟热基因原核表达质粒的构建

  更多相关文章： 犬瘟热病毒 犬瘟热病毒关键抗原 单域抗体 噬菌体展示技术 原核表达

【摘要】：犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒引起的一种高度接触性的急性病毒病。临床上以双相热,红疹,结膜炎,白细胞减少及中枢神经系统损害为主要特征。近年来,犬瘟热疫苗的防治效果逐渐下降,而单克隆抗体以其较高的特异性被广泛应用于诊断和治疗方面,因此犬瘟热诊断治疗制剂的研究开发对犬瘟热的防治具有重要意义。骆驼体内存在天然缺少轻链的重链抗体,重链抗体的优点使其具有广泛的抗原结合能力。噬菌体展示技术主要将抗体分子展示于噬菌体表面后利用抗原筛选,再进行表达和功能鉴定,使基因工程抗体制备方法更方便快捷。本研究旨在制备犬瘟热病毒特异性单域抗体,同时选择具有中和活性的单域抗体制备犬瘟热单域抗体被动免疫制剂。通过犬瘟热病毒免疫双峰驼,分离外周血淋巴细胞后提取总RNA,再进行VHH基因的扩增。将VHH基因片段与pCANTAB5E载体连接,再将重组质粒电转化E.coli TG1,构建犬瘟热病毒单域抗体库,得到库容1.3×106。并将犬瘟热病毒关键抗原蛋白H、F、N克隆到原核表达载体pET28a中,重组质粒再转化到感受态细胞BL21 (DE3)中,构建好的表达质粒对接下来进行的抗体库筛选提供基础。相应单域抗体的制备,为治疗犬瘟热提供新的思路。
【关键词】：犬瘟热病毒 犬瘟热病毒关键抗原 单域抗体 噬菌体展示技术 原核表达
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 缩略语表9-10
• 1 引言10-19
• 1.1 犬瘟热的概述10-14
• 1.1.1 流行病学10-11
• 1.1.2 病原11
• 1.1.3 犬瘟热H、F、N蛋白及其主要功能特点11-12
• 1.1.4 发病机理12
• 1.1.5 临床症状12-13
• 1.1.6 病理变化13
• 1.1.7 诊断与防治13
• 1.1.8 犬瘟热的治疗现状及发展趋势13-14
• 1.2 单域抗体14-15
• 1.2.1 抗体14
• 1.2.2 骆驼抗体14-15
• 1.3 噬菌体展示技术15
• 1.4 噬菌体抗体库15-18
• 1.4.1 噬菌体抗体库的基本原理16
• 1.4.2 噬菌体抗体库的类型16-17
• 1.4.3 噬菌体抗体库的特点与优势17
• 1.4.4 噬菌体抗体库的发展17-18
• 1.5 研究目的和意义18-19
• 2 试验一 抗犬瘟热病毒单域抗体库的构建19-36
• 2.1 试验材料19-21
• 2.1.1 试验动物19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 PCR引物19-20
• 2.1.4 培养基和缓冲液的配制20-21
• 2.1.5 实验仪器和设备21
• 2.2 试验内容和方法21-29
• 2.2.1 骆驼的免疫21-22
• 2.2.2 血清抗体效价的测定22
• 2.2.3 采集骆驼全血22
• 2.2.4 外周血淋巴细胞分离22-23
• 2.2.5 提取淋巴细胞总RNA23
• 2.2.6 反转录合成cDNA23-24
• 2.2.7 单域抗体基因的扩增24-25
• 2.2.8 VHH片段的酶切和纯化25-26
• 2.2.9 pCANTAB5E载体的制备26-27
• 2.2.10 VHH片段与pCANTAB5E载体连接27-28
• 2.2.11 电转化感受态大肠杆菌TG128-29
• 2.2.12 抗体库的初步鉴定29
• 2.3 结果29-33
• 2.3.1 血清抗体效价ELISA测定29-30
• 2.3.2 VHH基因的扩增30-31
• 2.3.3 pCANTAB5E质粒酶切31-32
• 2.3.4 抗体库的鉴定32
• 2.3.5 序列分析32-33
• 2.4 讨论33-35
• 2.5 小结35-36
• 3 试验二 犬瘟热病毒H、F、N基因原核表达质粒的构建36-45
• 3.1 试验材料36
• 3.1.1 试验试剂36
• 3.1.2 引物36
• 3.1.3 试验仪器36
• 3.2 试验内容和方法36-40
• 3.2.1 提取RNA36
• 3.2.2 扩增H、F、N基因片段36-37
• 3.2.3 克隆质粒的构建37
• 3.2.4 表达质粒的构建37-40
• 3.3 结果40-43
• 3.3.1 H、F、N基因的扩增40
• 3.3.2 重组质粒的鉴定40-41
• 3.3.3 重组质粒的酶切41
• 3.3.4 pET28a质粒酶切41-42
• 3.3.5 表达质粒的鉴定42-43
• 3.3.6 表达质粒序列测定43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 小结44-45
• 4 结论45-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-51
• 作者简介51

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本文编号：1085013