黄连与环丙沙星联用对鸡源性沙门菌生物被膜的影响

发布时间：2017-10-24 02:34

  本文关键词：黄连与环丙沙星联用对鸡源性沙门菌生物被膜的影响

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【摘要】：沙门菌病(salmonellosis)是指各类沙门菌所导致的不同临床表现的疾病总称,人畜感染后常表现为胃肠炎、败血症、局部化脓感染等症状,给畜牧业和公共卫生均带来了严峻的挑战。近年来,由于抗菌药物的滥用,使得沙门菌耐药性问题日益严重,甚至形成细菌生物被膜。细菌生物被膜(Bacterial biofilm,BF)是黏附于载体表面,分泌胞外大分子物质并将其自身包绕其中而形成的细菌聚集膜样物。研究显示,生物被膜形成可引起沙门菌耐药性的产生,临床上80%的感染都和生物被膜相关,这就迫切需要开发新型抗菌药。由于中草药在抑制细菌生物被膜时具有不易产生耐药性和毒副作用等优势,且与抗菌药物联用能发挥抗菌增效协同的作用,而越来越受到青睐。因此,本课题筛选出对耐药沙门菌有较好抑菌效果的中药,研究其与环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)体外联用对生物被膜的影响,以及对生物被膜形成相关基因lux S、rpo E和omp R表达的调控作用。利用Kirby-Bauer法检测12株沙门菌分离株对10种抗菌药物的敏感性。结果显示,分离株对氨苄西林的耐药率最高,为58.3%;对诺氟沙星的耐药率达到50%;对卡那霉素、庆大霉素、头孢唑啉、四环素的耐药率也较高,分别为41.7%、41.7%、33.3%、25%。多重耐药率为41.7%(5/12),耐药谱以AMP-GEN-CFZ-KAN为主,其中8号分离株可耐9种抗菌药物,耐药表型最为复杂,选作实验菌株。以75%乙醇为溶剂,采用超声波法分别提取黄连、黄芩、五倍子、丁香叶,得到4味中药醇提物;采用96孔板微量稀释法测定中药醇提物和环丙沙星对沙门菌最低抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)值。结果显示,黄连较其他味3中药表现出较好的抑菌效果(MIC=6250μg·mL-1)。将黄连醇提物进一步精提后,得到粗品5.31 g,提取率为8.17%,MIC值为3125μg·mL-1。利用微量棋盘法测定黄连提取物与环丙沙星体外联合药敏实验,结果显示,两药联用FIC指数为0.75,说明两药联用为相加作用。在96微孔板中采用结晶染色法分别测定两药单用以及两药联用对生物被膜黏附率(B)值的影响;利用XTT试剂,绘制生物被膜生长曲线;在24孔板中制备生物被膜,利用扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察沙门菌生物被膜结构,以及不同浓度药物对其的影响;采用RT-PCR法,检测不同药物对lux S、rpoE、omp R基因表达量的影响。生物被膜黏附率、生长曲线以及扫描电镜结果均表明,阳性对照CVCC528菌株生物被膜形成能力极弱,8号分离株形成了典型而完整的生物被膜,且生长速率随着时间不断变化,在18-30 h期间,细菌活力提高较快,在72 h达到最高。两药联用表现出较强的抑制生物被膜黏附率、降低生长速率,并严重破坏生物被膜的微观结构,抑制lux S,rpo E和omp R基因mRNA表达的作用,其抑制效果与药物浓度呈正相关,在1/2MIC浓度时效果最好(p0.01),说明两药联用对耐药沙门菌产生增效协同作用,可相对减少环丙沙星的用药剂量。综上所述,黄连对沙门菌的抑制作用优于黄芩,五倍子、丁香叶;黄连提取物与环丙沙星体外联用提高了环丙沙星的抗菌效果;黄连、环丙沙星及两药联用均能抑制耐药沙门菌生物被膜的黏附率、生长速率,并显著破坏生物被膜的微观结构,其在分子水平的作用机理与下调lux S,rpo E和omp R基因表达有关,且联合用药在一定程度上表现出优于单一用药的作用。因此,黄连提取物与环丙沙星联用在抑制细菌生物被膜方面有较大的应用前景。本研究就目前中西医结合来防治沙门菌临床感染提供新的理论依据,并为沙门菌生物被膜分子水平的相关耐药机制的研究提供了新的理论基础和实验依据。
【关键词】：黄连 环丙沙星 沙门菌 生物被膜 联合用药
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-23
• 1.1 沙门菌概述12
• 1.1.1 沙门菌流行性12
• 1.1.2 沙门菌的耐药现状12
• 1.2 沙门菌的耐药机制12-14
• 1.2.1 耐药性产生的遗传机制12-13
• 1.2.2 沙门菌产生耐药性的生化机制13-14
• 1.3 细菌生物被膜概述14-20
• 1.3.1 生物被膜的形成机制15
• 1.3.2 生物被膜形成的影响因素15-18
• 1.3.3 生物被膜的检测方法18
• 1.3.4 细菌生物被膜的控制策略18-20
• 1.4 相关中药研究进展20-21
• 1.4.1 黄连20-21
• 1.4.2 黄芩21
• 1.4.3 五倍子21
• 1.4.4 丁香叶21
• 1.5 体外中西药联合用药21-22
• 1.6 本研究目的与意义22-23
• 2 材料与方法23-34
• 2.1 试验材料23-25
• 2.1.1 菌株23
• 2.1.2 药物23
• 2.1.3 主要实验仪器23-24
• 2.1.4 主要试剂24
• 2.1.5 药敏纸片24
• 2.1.6 试剂盒24
• 2.1.7 主要试剂配制24-25
• 2.2 实验方法25-34
• 2.2.1 细菌复苏与冻存25
• 2.2.2 沙门菌分离株药物敏感性试验25-26
• 2.2.3 药物的最低抑菌浓度的测定26-27
• 2.2.4 体外联合药敏试验27-28
• 2.2.5 生物被膜黏附率测定28-29
• 2.2.6 绘制生物被膜的生长曲线29
• 2.2.7 生物被膜微观结构29-30
• 2.2.8 药物对生物被膜相关基因的调控30-34
• 3 结果与分析34-46
• 3.1 沙门菌分离株药敏试验结果34-35
• 3.2 沙门菌最低抑菌浓度测定结果35
• 3.2.1 中药提取35
• 3.2.2 沙门菌最低抑菌浓度的测定35
• 3.3 黄连与环丙沙星体外联用35-36
• 3.4 生物被膜黏附率测定结果36-38
• 3.5 生物被膜的生长曲线38-39
• 3.6 生物被膜的微观结构39-41
• 3.7 qRT-PCR检测结果41-46
• 3.7.1 总RNA和引物电泳检测结果41-42
• 3.7.2 qRT-PCR的溶解曲线42-43
• 3.7.3 qRT-PCR的扩增曲线43
• 3.7.4 qRT-PCR扩增结果43-46
• 4 讨论46-51
• 4.1 沙门菌耐药性分析46
• 4.2 中药对沙门菌的抑菌作用46-47
• 4.3 中西药联用对沙门菌的抑制作用47-48
• 4.4 药物对沙门菌生物被膜的影响48-49
• 4.5 药物对生物被膜相关基因的调控49-51
• 5 结论51-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-59
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文59

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