禽呼肠孤病毒感染对体外细胞和SPF鸡Toll样受体mRNA转录影响的初步研究

发布时间：2017-10-24 18:43

  本文关键词：禽呼肠孤病毒感染对体外细胞和SPF鸡Toll样受体mRNA转录影响的初步研究

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【摘要】：禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)是重要的家禽病原体之一,可导致鸡病毒性关节炎、免疫抑制、呼吸障碍综合征等,给养禽业造成巨大的经济损失。前人研究表明, ARV的研究方向有病毒检测方法的建立、病原体的分离鉴定、病毒基因组的测序等几个方面,然而对于ARV在分子致病机制方面的研究报道并不多见。为了能够有效防控ARV的感染,因此需要进一步对禽呼肠孤病毒进行分子致病机制方面的研究。鸡Toll样受体是天然免疫分子,能识别病原相关分子模式在机体天然免疫系统起防御作用,同时还能启动获得性免疫,是连接机体天然免疫应答和获得性免疫的重要介质。目前已证明鸡Toll样受体在禽流感感染、鸡传染性法氏囊病毒感染、马立克氏病毒感染、细菌感染、寄生虫感染等致病过程中占有重要作用,但有关ARV感染导致机体鸡Toll样受体的转录量变化和免疫抑制的致病机制少有报道。为探讨ARV感染对鸡Toll样受体ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA转录的影响,本研究首先建立了鸡ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA的SYBR Green II实时荧光染料相对定量PCR检测方法,体内外试验分别用ARV标准强毒株S1133株感染7日龄SPF雏鸡和体外鸡胚成纤维细胞(CEF), real-time PCR方法检测与分析ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21在体外CEF细胞和SPF鸡体内不同组织器官(外周血淋巴细胞、肝脏、心脏、胸腺、脾脏、法氏囊和关节)中不同试验时间点的相对转录量变化情况。根据GenBank上公布的鸡ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21和内参基因(GAPDH)序列,运用生物软件设计特异性引物并送公司合成。抽提SPF鸡脾脏的RNA反转录成cDNA为模版构建的重组质粒,绘制鸡Toll样受体SYBR Green Ⅱ实时荧光染料相对定量PER标准曲线。结果表明所检测的受体基因的溶解曲线均为单峰,扩增效率接近100%,线性相关性大于0.99,基因检测下限达到荧光定量检测要求。说明本研究建立的Toll样受体检测方法可以应用于荧光定量检测。运用已建立鸡Toll样受体的荧光定量PER检测方法,检测ARV标准强毒株S1 133感染鸡胚成纤维细胞CEF后,ARV结构蛋白σC和ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的动态转录水平。检测结果发现,ARV感染CEF后其结构蛋白于48h时相对转录量显著上调并且达到峰值(P0.01)；同时,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA相对转录量发生显著变化,在感染72h内各个受体的mRNA相对转录量呈波浪式变化。ChTLR3 mRNA相对转录量在感染后24h上调6.5倍；ChTLR5 mRNA相对转录量分别在感染前期(10h)和后期(72h)分别达到峰值,其相对转录量分别上调20.67倍和18.38倍;ChTLR7 mRNA相对转录量在感染后6h达到峰值,相对转录量为对照组的9.22倍；ChTLR15 mRNA相对转录量在感染12h呈现峰值,相对转录量上调14.23倍；ChTLR21mRNA相对转录量在感染10h后上调13.74倍。五个不同滴度的ARV病毒感染CEF24h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21 mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述试验结果表明： ARV感染后可诱导CEF中ChTLR3、 ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化,提示可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。动物试验7日龄SPF经足垫途径注射ARV标准强毒S1133株,real-time染料相对定量PCR方法分别检测感染鸡后不同组织器官(外周血淋巴细胞、肝脏、心脏、胸腺、脾脏、法氏囊和关节)中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的相对转录量变化情况。检测结果发现,ARV感染可引起上述鸡Toll样受体mRNA在不同试验时间点转录水平发生显著的变化,以此推测上述Toll样受体相对转录量的变化可能与ARV感染SPF鸡后引起的不同组织器官损伤有关。其中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA在关节中相对转录量发生显著变化,ARV感染后第3d相对转录量显著上调,随后第14d相对转录量显著下调(P0.05 or P0.01),推测这些受体的相对转录量变化可能与ARV感染导致的关节病变有关。心脏中ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相对转录量在感染第3d显著上调(P0.01 or P0.05),推测以上受体的相对转录量的改变可能与ARV感染引起的心脏损伤相关联。肝脏中ChTLR3基因mRNA相对转录量在感染第1d显著上调(P0.05),而ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相对转录量在感染第3d显著上调(P0.05 or P0.01),推测它们相对转录量的变化可能与ARV感染所致的肝脏脏损伤相关。ChTLR3、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相对转录量在不同免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)中均有不同程度的上调,其中免疫器官中ChTLR3基因mRNA相对转录量在感染第1 d显著上调(P0.05 or P0.01)；脾脏中ChTLR7基因mRNA相对转录量在感染第5d显著上调(P0.01),ChTLR7基因mRNA相对转录量在胸腺和法氏囊中在免疫器官中在感染第1d显著上调(P0.05),其他受体在不同时间点相对转录量也有明显的变化,推断免疫器官中各个受体相对转录量的变化可能与ARV引起的免疫抑制有关。外周血淋巴细胞中ChTLR3和ChTLR21基因mRNA相对转录量在感染第1d显著下调,前者至第7d显著下调到最低值,而后者开始慢慢上调(P0.05 or P0.01)；ChTLR7基因mRNA相对转录量在感染第7d显著上调并达到峰值(P0.01)；其他受体的相对转录量也有明显的变化,提示它们相对转录量的变化可能与ARV感染所致外周血淋巴细胞免疫调节相关。本研究完成了禽呼肠孤病毒感染的体外鸡胚成纤维细胞和SPF鸡组织器官以及外周血淋巴细胞中鸡Toll样受体(ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21)基因的mRNA相对转录量动态的检测结果,从体外细胞和体内SPF鸡体两个试验模型分析了不同鸡Toll样受体在ARV感染后相对表达量的变化,旨在更好的研究禽呼肠孤病毒的致病机制。
【关键词】：禽呼肠孤病毒 鸡Toll样受体 real-time PCR 转录水平
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 论文中的英文缩写及中文对照表13-17
• 第一章 文献综述17-25
• 1.1 禽呼肠孤病毒研究的进展17-20
• 1.1.1 禽呼肠孤病毒的简介17-18
• 1.1.2 ARV的形态和结构18-19
• 1.1.3 ARV的增殖特性19
• 1.1.4 禽呼肠孤病毒的诊断与防治19-20
• 1.2 鸡Toll样受体的研究进展20-22
• 1.2.1 Toll样受体的概念20
• 1.2.2 Toll样受体的结构与分类20-21
• 1.2.3 鸡Toll样受体的功能21-22
• 1.3 SYBR Green Ⅱ实时荧光定量PCR22-23
• 1.3.1 SYBR Green Ⅱ实时荧光定量PCR原理22-23
• 1.3.2 SYBR Green Ⅱ实时荧光定量PCR应用23
• 1.4 本课题研究的意义23-25
• 第二章 鸡TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21 mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立25-37
• 2.1 材料与方法26-30
• 2.1.1 主要仪器与试剂26
• 2.1.2 引物设计与合成26-27
• 2.1.3 SPF鸡脾脏RNA抽提与反转录27-28
• 2.1.4 标准品制备28-29
• 2.1.5 目的基因条件的优化29
• 2.1.6 目的基因标准曲线试验29
• 2.1.7 溶解曲线试验29-30
• 2.1.8 敏感性试验30
• 2.1.9 重复性试验30
• 2.2 结果30-36
• 2.2.1 RNA抽提结果30-31
• 2.2.2 质粒标准品的制备结果31
• 2.2.3 real-time PCR条件优化结果31-32
• 2.2.4 各个目的基因标准曲线的制作结果32-33
• 2.2.5 溶解曲线试验结果33-34
• 2.2.6 各个基因的敏感性试验结果34-36
• 2.2.7 重复性试验结果36
• 2.3 讨论36-37
• 第三章 禽呼肠孤病毒感染体外鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的变化37-45
• 3.1 材料与方法39-41
• 3.1.1 病毒39
• 3.1.2 主要试验试剂和仪器39
• 3.1.3 细胞的制备与培养39
• 3.1.4 呼肠孤病毒TCID50测定39
• 3.1.5 呼肠孤病毒感染方法39-40
• 3.1.6 收集细胞样品40
• 3.1.7 CEF细胞的RNA抽提与反转录40
• 3.1.8 样品测定40
• 3.1.9 数据统计分析40-41
• 3.2 结果41-44
• 3.2.1 ARV病毒结构蛋白6C基因的相对转录变化41
• 3.2.2 ARV S1133株感染CEF后鸡Toll样受体的转录水平变化41-43
• 3.2.3 不同接种剂量ARV感染CEF细胞24h后鸡Toll样受体的表达变化43-44
• 3.3 讨论44-45
• 第四章 ARV感染对SPF鸡组织器官中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录的影响45-70
• 4.1 材料与方法47-48
• 4.1.1 主要试剂和仪器47
• 4.1.2 试验动物47
• 4.1.3 ARV感染SPF鸡试验47
• 4.1.4 SPF鸡剖检及组织样品采集47
• 4.1.5 采集样品的RNA抽提和反转录47-48
• 4.1.6 试验样品的Real-time PCR测定48
• 4.1.7 试验数据处理和分析48
• 4.2 结果48-67
• 4.2.1 SPF鸡感染呼肠孤病毒后的临床表现48-54
• 4.2.1.1 SPF鸡体重及各个器官的变化情况48-53
• 4.2.1.2 SPF鸡感染ARV后各个器官的临床表现53-54
• 4.2.2 关节中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录量的变化54-56
• 4.2.3 心脏中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录量的变化56-58
• 4.2.4 肝脏中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录量的变化58-60
• 4.2.5 脾脏中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录量的变化60-62
• 4.2.6 胸腺中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录量的变化62-64
• 4.2.7 法氏囊中5种鸡Toll样受体mRNA相对转录量的变化64-65
• 4.2.8 外周血淋巴细胞中5种鸡Toll样受体基因mRNA相对转录量的变化65-67
• 4.3 讨论67-70
• 结论70-71
• 参考文献71-76
• 致谢76-77
• 个人简历77
• 攻读学位期间发表论文情况77

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本文编号：1090065