禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白纳米抗体的筛选及活性检测
本文关键词：禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白纳米抗体的筛选及活性检测
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【摘要】：禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)主要侵害幼禽的中枢神经系统,引起雏鸡、火鸡、鹌鹑等出现共济失调、麻痹和头颈震颤。产蛋鸡感染AEV后无明显神经症状,但能引起产蛋量的下降。AEV VP1蛋白高度保守且是主要的宿主保护性免疫蛋白,含有大多数特异性中和位点和主要的中和表位。目前AE缺乏有效的诊断和治疗方法,只能通过免疫接种进行预防。针对AEV高效、特异、廉价抗体的开发,更有利于AEV的早期检测和研究。纳米抗体对抗原亲和力和特异性高、稳定性强、成本低,便于大规模生产,在病原的检测与研究方面有广阔的应用前景。本研究的目的是以AEV-VP1蛋白作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交技术对非免疫双峰驼纳米抗体酵母文库进行筛选,期望得到能与AEV反应活性高的纳米抗体,为该病的诊断和病原学研究奠定基础。主要获得以下结果:1.设计合成1对含有EcoR I、Sal I双酶切位点的特异性引物,采用PCR方法扩增AEV SX株VP1基因,将其克隆到pGBKT7载体上,命名为pBD-VP1,对其进行序列测定分析,结果表明,克隆的VP1基因序列没有突变。所构建的pBD-VP1诱饵质粒无毒性和自激活作用,可用于文库的筛选。2.将30℃过夜培养收集的4 mL诱饵菌[Y2H Gold(pBD-VP1)]与1 mL文库菌[Y187(pAD-VHH)]混合、进行杂交。杂交后将形成的结合子离心后涂于50个150 mm DDO(-Ade-His-Trp-leu)/X/A平板,30℃培养3 d~5 d,对筛选到的蓝色菌落进行标记。选择200个阳性克隆中的40个优势菌落转接QDO/X/A平板进行培养,获得了9个阳性克隆。对9个阳性克隆进行了酵母回转验证、序列测定与比对分析,最终获得了8株抗AEV SX株VP1蛋白的纳米抗体。3.构建原核表达载体pET28as-VHH,将重组质粒pET28as-VHH转入BL21(DE3)表达菌中,对最适表达温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,最适IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L、最适诱导表达温度为30℃、最适诱导时间为3 h。纯化产物经SDS-PAGE分析,8株抗AEV SX株VP1蛋白的重组纳米抗体大小约为34 ku,与预期结果相符。4.用间接ELISA测定重组VHH的反应活性,结果表明:未经稀释的阳性对照孔OD450平均值为1.056[OD450=1.056(D4501)],阴性对照孔OD450平均值0.048[OD450=0.048(OD450㩳0.1)]。参考IDEXX提供的判定标准,阴阳性对照均成立,标签样品为阴性对照2的OD450㩳0.05,表示反应很微弱。阳性对照在5个不同稀释度下反应活性成线性关系依次降低。VHH4和VHH9的反应原性高于阳性对照,且VHH9的高于VHH4;其余6株低于阳性对照。5.鸡胚中和试验测定重组VHH中和效价,结果表明:阳性血清中和效价为1:717,VHH9和VHH4中和效价分别为1:609和1:512,说明筛选的两株纳米抗体VHH9和VHH4具有较好的中和效价。综上所述,本研究采用酵母双杂交技术对非免疫双峰驼纳米抗体酵母文库进行了筛选。通过共转验证、序列比对分析,成功获得了8株抗AEV SX分离株VP1蛋白的重组纳米抗体。将获得的8株纳米抗体表达、纯化后通过间接ELISA和鸡胚中和试验对其进行活性了检测,最终获得了2株活性较好的纳米抗体,为AEV抗原检测和病原学研究奠定了一定的基础。
【关键词】：AEV 纳米抗体 酵母双杂交 原核表达 间接ELISA 鸡胚中和试验
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：
- 摘要5-7
- ABSTRACT7-12
- 文献综述12-23
- 第一章 禽脑脊髓炎研究进展12-18
- 1.1 AEV病原学特征12-15
- 1.1.1 AEV的历史背景与分类12
- 1.1.2 病毒的形态特征及理化性质12-13
- 1.1.3 病毒的增殖培养13
- 1.1.4 AEV基因组13-14
- 1.1.5VP1蛋白及功能14
- 1.1.6 AEV VP1蛋白抗原表位分析14-15
- 1.2 AE的流行病学15-16
- 1.3 AEV致病机理16
- 1.4 AE临床症状和病理变化16
- 1.5 AEV检测16-17
- 1.6 AE的防制17-18
- 第二章 纳米抗体研究进展18-23
- 2.1 纳米抗体的结构18-19
- 2.2 纳米抗体的性质19-20
- 2.2.1 亲和力高19
- 2.2.2 高稳定性和水溶性19-20
- 2.2.3 识别独特的抗原表位20
- 2.2.4 容易表达和规模化生产20
- 2.2.5 易多聚化成多价抗体20
- 2.3 纳米抗体的应用20-23
- 2.3.1 在基础研究领域的应用20-21
- 2.3.2 作为诊断工具的使用21-23
- 实验研究23-48
- 第三章 禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白纳米抗体的筛选23-35
- 3.1 材料23-25
- 3.1.1 菌株、质粒、文库23
- 3.1.2 引物23-24
- 3.1.3 酶和试剂24
- 3.1.4 主要培养基及常用试剂的配制24-25
- 3.1.5 主要仪器25
- 3.2 方法25-28
- 3.2.1 pBD-VP1诱饵质粒的构建25-27
- 3.2.2 诱饵质粒pBD-VP1毒性和自激活检测27
- 3.2.3 文库筛选与鉴定27-28
- 3.3 结果28-33
- 3.3.1 AEV VP1基因扩增28-29
- 3.3.2 诱饵质粒PCR和双酶切鉴定29
- 3.3.3 诱饵质粒pBD-VP1测序29-30
- 3.3.4 诱饵质粒pBD-VP1自激活检测30
- 3.3.5 文库筛选30-31
- 3.3.6 蓝色菌落进行菌落PCR鉴定31
- 3.3.7 共转验证31-32
- 3.3.8 阳性文库质粒测序32-33
- 3.4 讨论33-34
- 3.5 小结34-35
- 第四章 禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白纳米抗体的表达纯化与活性检测35-48
- 4.1 材料35-36
- 4.1.1 质粒、载体和菌株35
- 4.1.2 主要试剂35
- 4.1.3 常用缓冲液配制35-36
- 4.1.4 主要仪器设备36
- 4.2 方法36-41
- 4.2.1 pET28as-VHH表达载体的构建36-39
- 4.2.2 诱导表达纳米抗体39-40
- 4.2.3 纳米抗体的制备纯化40
- 4.2.4 间接ELISA检测VHH的活性40-41
- 4.2.5 鸡胚中和试验检测VHH的活性41
- 4.3 结果41-47
- 4.3.1 pET28as-VHH表达载体的PCR鉴定41
- 4.3.2 pET28as-VHH表达载体的酶切鉴定41-42
- 4.3.3 pET28as-VHH表达载体测序42-43
- 4.3.4 pET28as-VHH重组蛋白存在形式的检测43
- 4.3.5 IPTG最佳诱导温度的确定43-44
- 4.3.6 IPTG最佳诱导浓度的确定44
- 4.3.7 最佳诱导时间的确定44-45
- 4.3.8 重组VHH的表达与纯化45-46
- 4.3.9 a重组VHH与AEV的反应活性46
- 4.3.410 b鸡胚中和试验测定VHH活性46-47
- 4.4 讨论47
- 4.5 小结47-48
- 结论48-49
- 参考文献49-56
- 附录56-60
- 致谢60-61
- 作者简介61
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