重组hIFITM3腺病毒的构建及抗流感病毒作用研究

发布时间：2017-10-27 11:13

  本文关键词：重组hIFITM3腺病毒的构建及抗流感病毒作用研究

  更多相关文章： 干扰素诱导跨膜蛋白3 禽流感病毒 腺病毒 抑制作用

【摘要】：近年发现的一类宿主限制因子,干扰素诱导跨膜蛋白(IFITMs)。该类因子可抑制包膜和无包膜病毒的增殖,并且在多种细胞中有一定的组成型表达,其中经研究证实IFITM3可以抵抗多种病毒的感染,其中包括西尼罗河病毒,流感病毒,登革热等。FITM3可通过多种途径来发挥抗病毒感染作用。据报道,IFITM3对以H1N1、H5N1、H7N9及H3N2、为外膜的假型病毒的进入具有抑制作用。其能够有效作用于宿主细胞表面受体与流感病毒表面糖蛋白血凝素结合之后,包膜与内吞形成的胞内体膜融合之前的感染胞内体过程。为深入研究IFITM3的抗病毒作用,本研究首先利用腺病毒pacAd载体构建了含有人干扰素诱导跨膜蛋白IFITM3目的基因的穿梭质粒,再与骨架质粒pAd5共转染HEK-293细胞,包装出含IFITM3基因的重组腺病毒,随后用PCR及Western blot检测该重组野生型腺病毒、腺病毒与正常细胞中IFITM3蛋白表达量的差异。本研究同时用Western blot方法检测同源细胞A549和异源细胞MDCK中IFITM3蛋白的表达,以选择合适的细胞模型。用MTS方法分别检测重组腺病毒对MDCK和A549细胞活性的影响。流感病毒感染细胞,用MTS方法,选择病毒滴度为100 MOI、感染时间为24h进行实验,检测细胞活性变化。MDCK口A549细胞接种重组腺病毒以及流感病毒后12h、24h、36h和48h分别收取RNA和细胞蛋白,用实时荧光定量PCR方法检测流感病毒M2基因表达量,用Western blot方法检测流感病毒HA蛋白表达量。PCR及Western blot检测显示本研究新构建的重组腺病毒IFITM3蛋白表达量显著高于野生型腺病毒和正常细胞,表明成功构建含有IFITM3的重组腺病毒。MTS实验发现腺病毒对细胞活性有一定抑制作用且具有时间和剂量依赖性,但rAd-IFITM3与wtAd5组之间无显著性差异,而流感病毒在感染细胞24h后,对细胞产生明显的抑制作用,且呈明显的时间与剂量依赖效应。Western blot结果显示,在接种流感病毒后12h时,HA蛋白的表达量最低且显著低于其他时间点。荧光定量PCR结果表明,过表达ITIFM3的A549细胞在不同时间点均对流感病毒转录水平有明显的抑制作用；对于MDCK细胞,6h、12h具有明显抑制作用。综上所述,本实验成功构建了含有IFITM3基因的重组腺病毒rAd-IFITM3,该重组腺病毒rAd-IFITM3在接种MDCK和A549细胞后,可在蛋白表达水平和基因转录水平上对流感病毒起到抑制的作用。本研究为深入探讨IFITM3限制病毒感染的作用机制提供了基础。
【关键词】：干扰素诱导跨膜蛋白3 禽流感病毒 腺病毒 抑制作用
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 前言12-26
• 1 抗流感病毒主要宿主限制因子研究进展12-20
• 1.1 流感病毒概述12
• 1.2 宿主限制因子抗流感病毒作用12-20
• 2 IFITMs研究进展20-24
• 2.1 IFITMs家族20-21
• 2.2 IFITMs广谱抗病毒作用21-22
• 2.3 IFITMs蛋白结构和细胞分布22-23
• 2.4 IFITM3抗病毒作用机制23-24
• 3 本研究的目的与意义24-26
• 材料和方法26-45
• 1 材料26-29
• 1.1 细胞、质粒、酶26
• 1.2 主要试剂26-27
• 1.3 主要仪器27-28
• 1.4 主要溶液及培养基28-29
• 2 方法29-45
• 2.1 含hIFITM3基因的重组腺病毒穿梭质粒的构建与鉴定29-31
• 2.2 携带hIFITM3基因的重组腺病毒的包装31-35
• 2.3 重组腺病毒的鉴定35-40
• 2.4 重组腺病毒扩增及滴度测定40-41
• 2.5 重组腺病毒表达IFITM3蛋白体外抗流感作用分析41-45
• 结果45-59
• 1 含hIFITM3基因的重组腺病毒穿梭质粒的鉴定45-46
• 1.1 目的基因的获取45
• 1.2 含IFITM3基因重组腺病毒穿梭质粒的鉴定45-46
• 2 携带IFITM3基因的重组腺病毒包装46-48
• 2.1 质粒大提与浓度鉴定46
• 2.2 质粒线性化46-47
• 2.3 质粒抽提纯化47
• 2.4 重组腺病毒转染(包装)47-48
• 3 重组腺病毒的鉴定48-50
• 3.1 细胞基因组提取及PCR鉴定48-49
• 3.2 重组腺病毒PCR鉴定49
• 3.3 Western blot分析靶蛋白表达49-50
• 3.4 Western blot分析IFITM3在细胞中的定位50
• 4 重组腺病毒扩增及滴度测定50-53
• 4.1 重组腺病毒扩增50-51
• 4.2 重组腺病毒滴度测定51-52
• 4.3 重组腺病毒电镜观察52-53
• 5 重组腺病毒表达IFITM3蛋白体外抗流感作用分析53-59
• 5.1 MTS分析腺病毒对细胞活性或增值的影响53-54
• 5.2 重组腺病毒在细胞中过表达外源基因研究54-56
• 5.3 重组腺病毒体外抗流感作用研究56-59
• 讨论59-61
• 结论61-62
• 参考文献62-68
• 致谢68-70
• 作者简介70

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;科学家给出全球流感病毒传播“路线图”[J];中华中医药学刊;2008年06期

2 ;甲型H1N1流感病毒[J];饲料工业;2009年10期

3 ;为什么“猪流感病毒”改称甲型H1N1流感病毒?[J];中华疾病控制杂志;2009年03期

4 李皓;;流感病毒与防控措施[J];科技潮;2009年12期

5 ;A型流感病毒复制机理研究获进展[J];中国家禽;2013年08期

6 陈慧英;;流感病毒将可“定位追踪”[J];泸州科技;2013年03期

7 ;高温、紫外线等是流感病毒的克星[J];农村科学实验;2005年12期

8 郑宾;钟江;;禽流感蔓延给人类敲响警钟[J];科学生活;2005年11期

9 张田勘;;从“小病”到“大疫”:多变的流感病毒[J];中国新闻周刊;2013年03期

10 王小平;;流感病毒的变异[J];大自然探索;1989年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 伍锐;段正赢;刘泽文;杨克礼;梁望旺;邓均华;周丹娜;田永祥;;A型流感病毒为载体的开发及其应用[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年

2 杜雄伟;李叶;杨卓;;A型流感病毒对小鼠致病机制的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年

3 曲敬来;;流感病毒A上呼吸道感染快速诊治的研究[A];中医药防治感染病之研究（九）——第九次全国中医药防治感染病学术交流大会论文集[C];2009年

4 高福;;流感病毒侵入与多肽抑制药物[A];第二届传染病诊治高峰论坛暨2009年浙江省感染病、肝病学术年会论文汇编[C];2009年

5 杨琴;张兴晓;杨灵芝;郭庆栋;;流感病毒在三种细胞中的生长对比[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年

6 袁达康;黄勇;杨华可;黎景全;李艳芬;;东莞市2004-2008年流感病毒监测结果及分析[A];新发传染病防治学习研讨会论文集[C];2008年

7 高玉伟;夏咸柱;扈荣良;王立刚;刘丹;邹啸环;黄耕;贺文琦;;虎流感病毒的分离、鉴定、基因分析与抗体调查(摘要)[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

8 李叶;廖明;辛朝安;;A型流感病毒对小鼠致病机制的研究进展[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年

9 曲敬来;常晓;;流感病毒A上呼吸道感染快速诊治的研究[A];2005年全国危重病急救医学学术会议学术论文集[C];2005年

10 祝艳华;王雯慧;陈怀涛;;中药抗流感病毒作用的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十五次、中国病理生理学会动物病生专业委员会第十四次学术讨论会论文集[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 江卉邋通讯员 胡运海 实习生 汪红燕;今冬江城流感病毒有加剧趋势[N];湖北日报;2008年

2 ;新流感病毒可能已在猪身上悄悄传播多年[N];新华每日电讯;2009年

3 记者 葛进　陈超;日拍到新型流感病毒真实形态[N];科技日报;2009年

4 特约记者 吴志军　记者 蔡鹏程;研制成功迅速杀灭流感病毒新产品[N];解放军报;2009年

5 河北省邢台市第一医院副主任医师 黄根柱;流感病毒有四怕[N];健康报;2009年

6 本报记者 马佳;陈继明：为流感病毒绘制族谱[N];北京科技报;2009年

7 江南雪舞;禽流感病毒与流感病毒有何关系？[N];大众卫生报;2005年

8 主任医师 冀衡;流感病毒[N];农村医药报（汉）;2003年

9 杨孝文　编译;揭开20世纪初西班牙大流感致命秘密[N];北京科技报;2007年

10 本报驻美国记者 毛黎;“狼”依然在家门口徘徊[N];科技日报;2008年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张文婧;抗A型流感病毒和肠道病毒71型天然化合物的筛选及其抗病毒分子机制研究[D];武汉大学;2012年

2 吴玲;A型流感病毒四种亚型同步检测分型方法建立及两株H5N1亚型禽流感病毒地方株的特性研究[D];武汉大学;2013年

3 范文辉;犬Ⅲ型干扰素的功能特点及B型流感病毒NEP蛋白出核功能研究[D];广西大学;2015年

4 申新田;寡聚噻吩及皂苷类衍生物抑制流感病毒进入靶细胞的作用及机制[D];南方医科大学;2015年

5 赵化阳;小鼠动物模型在哮喘气道高反应治疗和抗流感药物筛选中的应用研究[D];中国农业大学;2015年

6 万志敏;抗体压下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析[D];扬州大学;2015年

7 林焱;H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株基因组特征与致病特性研究[D];南京农业大学;2014年

8 高伟;新型甲型H1N1流感病毒致ALI发病机制研究—炎症、细胞凋亡以及免疫调控[D];南京大学;2012年

9 阳元娥;抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备、活性评价及其应用研究[D];广东工业大学;2016年

10 江静雯;B型流感病毒诱发天然免疫应答及M1核质穿梭对于病毒复制的调控研究[D];中国科学技术大学;2016年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 孟慧芝;A型流感病毒条形码检测技术研究[D];山西农业大学;2015年

2 胡云光;人季节性流感病毒H3N2小鼠适应株的建立及分子机制的初步探究[D];北京协和医学院;2015年

3 刘兵;SPF鸡与BALB/c小鼠体内流感病毒唾液酸受体组织分布的差异性分析[D];中国农业科学院;2015年

4 戴玉柱;五重荧光定量RT-PCR检测甲型流感病毒方法的建立和应用及2010～2013年杭州地区人H3N2病毒流行病学分析[D];浙江大学;2015年

5 孙伟洋;B型流感病毒感染性克隆的构建及其免疫原性研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

6 王静;HD-11细胞感染H9N2流感病毒后先天性免疫相关基因mRNA表达变化的研究[D];西北农林科技大学;2015年

7 李朋;貂源H9N2亚型流感病毒的分子生物学特性及其致病性研究[D];山东农业大学;2015年

8 王倩;苦参主要成分的分离提取及其抗犬流感病毒的研究[D];山东农业大学;2015年

9 万勇;甲型流感病毒不同亚型混合感染分析及N9亚型流感病毒NA基因进化分析[D];天津医科大学;2015年

10 王攀;MicroRNA在甲型H1N1流感病毒介导肺部炎性损伤调控作用的研究[D];四川农业大学;2013年

，

本文编号：1103234