上海地区PCV2分子流行病学及PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的磷酸化蛋白组学研究

发布时间：2017-10-27 22:20

  本文关键词：上海地区PCV2分子流行病学及PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的磷酸化蛋白组学研究

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【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus diseases,PCVD)的主要病原,严重危害猪群健康的全球性重要的传染病。近年来,国内外有关PCV2感染报道日益增多,引起人们广泛的关注。为了了解上海地区PCV2流行状况,我们对PCV2开展了流行病学调查,并对PCV2进行了遗传变异分析。我国大多数地区猪群中PCV2的感染十分普遍,PCV2可能是一种猪场常在病原体,其中PCV2与其他病原体共感染现象非常严重。本实验借助蛋白质组学和磷酸化修饰手段先从体外实验分析PCV2感染猪肺泡巨噬细胞系(porcine alveolar macrophage,PAM)后细胞因子表达和蛋白质组学变化,探讨PCV2感染诱导炎症反应的机理,具体研究内容如下:1.PCV2分子流行病学调查2014年到2015年初期间,从上海浦东、闵行、嘉定、奉贤的所有规模化猪场中的疑似PCVD患病猪群和正常猪群中采集组织样品,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法,分别检测PCV1、PCV2。结果表明,PCV2感染阳性率为64.20%,从阳性病料中测序鉴定到10条PCV2序列,对其ORF2基因进行测序及分子遗传演化分析。结果发现,上海地区发病猪群中PCV2d为优势流行基因型,在同一猪场中同时存在PCV2d、PCV2b及PCV2e。表明PCV2不同基因型毒株在猪体内存在序列漂移现象。PCV2的ORF2同源性分析表明,本研究中的10株PCV2毒株之间同源性为90.3%~99%;10株PCV2毒株与国内毒株间同源性高达90.3%~99.3%,与国外毒株间同源性为90.0%~99.7%。表明国内、外PCV2毒株序列没有明显的地域差异。2.PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的磷酸化蛋白质组学研究本文分别利用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和间接免疫荧光技术(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测各个时间点PCV2的病毒滴度和不同细胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β)的mRNA表达水平,以此为依据,确定PCV2感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)的早期和晚期时间点,分别是24 h和60 h。利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantificationI,iTRAQ)定量组学的方法分别在PCV2感染后的24 h和60 h时研究磷酸化蛋白质的变化。本次研究中,我们鉴定了925独特的磷酸化蛋白,24 h和60 h鉴定到692个和691个磷酸化蛋白,这些磷酸化蛋白的变化为探究PCV2免疫抑制和致病机制提供了大量信息。分析磷酸化蛋白质组学数据,我们发现PCV2在感染宿主细胞时,抑制细胞凋亡,促进自噬,可能是由于Hippo和Notch信号通路以及磷酸肌醇信号的激活,导致部分蛋白质激酶发生变化。互作网络分析发现这些PCV2诱导而产生变化的磷酸化蛋白涉及到的生物过程包括细胞装配和组成、信号转导、蛋白合成、核酸代谢、新陈代谢、细胞活动等。这些信号通路和功能网络分析有助于我们进一步理解PCV2的致病机理,本研究为PCV2感染引起的免疫抑制和致病机制提供了基础数据。
【关键词】：PCV2 猪肺泡巨噬细胞 磷酸化蛋白质组 遗传变异
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-15
• 第一章 文献综述15-22
• 1.1 猪圆环病毒2型的发现及其流行病学发展15-16
• 1.1.1 PCV2的发现15
• 1.1.2 PCV2的流行与分布15
• 1.1.3 PCV2基因型分类和变化15-16
• 1.2 PCV2引起的相关疾病16-19
• 1.2.1 PMWS16
• 1.2.2 PRDC16-17
• 1.2.3 PDNS17
• 1.2.4 母猪繁殖障碍17
• 1.2.5 CT17-18
• 1.2.6 PNP18
• 1.2.7 与猪其他病原体并发感染18-19
• 1.3 PCV2致病机理19-20
• 1.3.1 PCV2免疫抑制机理19
• 1.3.2 PCV2感染与凋亡19-20
• 1.4 磷酸化蛋白质组学在病毒感染中的应用20-22
• 1.4.1 蛋白质磷酸化修饰简介20
• 1.4.2 病毒感染与磷酸化作用研究进展20-22
• 第二章 上海地区PCV2分子流行病学调查22-36
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 试剂22
• 2.1.2 病料22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 病料的处理23
• 2.2.2 提取病料组织中病毒的DNA/RNA23
• 2.2.3 病料中PCV1和PCV2检测23-24
• 2.2.4 PCV2-ORF2基因扩增24-25
• 2.2.5 PCV2-ORF2 PCR产物的回收纯化25
• 2.2.6 回收PCR产物连接PMD18-T载体25
• 2.2.7 制备感受态细胞25-26
• 2.2.8 连接产物的转化感受态细胞26
• 2.2.9 质粒小量的制备26-27
• 2.2.10 质粒PCR电泳鉴定27
• 2.2.11 序列测定与遗传变异分析27
• 2.3 结果27-34
• 2.3.1 病料中PCV1和PCV2基因扩增结果27-28
• 2.3.2 PCV2-ORF2基因扩增结果28-29
• 2.3.3 PCV2-ORF2-pMD-18T重组质粒的PCR鉴定29
• 2.3.4 PCV2-ORF2测序结果29-30
• 2.3.5 PCV2-ORF2核苷酸序列遗传进化分析30-33
• 2.3.6 PCV2-ORF2编码的氨基酸序列分析33-34
• 2.3.7 PCV2-ORF2核苷酸与氨基酸序列同源性分析34
• 2.4 讨论34-36
• 第三章 PCV2感染猪肺泡巨噬细胞磷酸化蛋白质组学研究36-53
• 3.1 材料36
• 3.1.1 毒株、质粒和细胞36
• 3.1.2 主要试剂36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 磷酸化蛋白质组学分析时间点的确定37-38
• 3.2.1.1 病毒接种37
• 3.2.1.2 间接免疫荧光法(IFA)检测PCV237
• 3.2.1.3 SYBR Green实时RT-PCR法检测细胞因子mRNA的变化37-38
• 3.2.4 细胞样品制备38
• 3.2.5 蛋白提取和酶解38-39
• 3.2.6 肽段标记和磷酸化肽段富集39
• 3.2.7 LC?MS/MS分析39
• 3.2.8 数据分析39
• 3.2.9 生物信息学分析39-40
• 3.3 结果40-51
• 3.3.1 PCV2检测时间点的确定40-41
• 3.3.1.1 IFA检测PCV2在PAM细胞系上的增殖40
• 3.3.1.2 SYBR Green实时RT-PCR法检测细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10的变化40-41
• 3.3.2 利用ITRAQ LC?MS/MS对PCV2感染的PAM细胞进行磷酸化蛋白质组学的定量分析41-42
• 3.3.3 亚细胞定位和功能注释分析42-45
• 3.3.4 磷酸化蛋白参与信号通路分析45-47
• 3.3.5 磷酸化蛋白间相互分析47-51
• 3.4 讨论51-53
• 第四章 全文结论53-54
• 参考文献54-60
• 附录 160-62
• 附录 262-74
• 致谢74-75
• 作者简历75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王海燕;刘文博;高崧;刘秀梵;;载体表达的siRNA分子对猪圆环病毒2型复制的抑制作用[J];微生物学报;2008年11期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 李文洁;我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）分子流行病学调查[D];华中农业大学;2009年

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本文编号：1105456