广西BTV感染及传播媒介调查、病毒分离鉴定与致病性初步研究

发布时间：2017-10-28 13:33

  本文关键词：广西BTV感染及传播媒介调查、病毒分离鉴定与致病性初步研究

  更多相关文章： 蓝舌病毒 中和试验 病原分离 病毒鉴定 动物攻毒试验

【摘要】：蓝舌病(bluetongue, BT)是由蓝舌病毒(bluetongue virus, BTV)引起的出血性疾病,目前已报道27个血清型。BT广泛分布于温带、亚热带及热带地区,通过嗜血媒介昆虫吮吸带毒血液后叮咬易感动物传播,反刍动物均能感染,羊、牛为本病主要易感动物。利用本实验室采集2009-2015年广西13市6683份牛羊血清,在检测出2032份BTV抗体阳性血清样品中,以C-ELISA方法筛选出500份强阳性血清,与OIE公布的BTV 1-24型标准毒株分别进行微量血清中和试验,发现广西畜群中存在BTV-1、2、3、4、5、8、9、11、15、16、17、18、19、20、22、23及24等17个血清型。其中,BTV-5、8、11、13、17、18、19、20、22为国内首次报道。统计分析表明,BTV-1、2和4为广西流行的优势血清型。此外,本研究还发现,广西畜群存在BTV不同血清型的混合感染。本研究在南宁市隆安县、玉林市兴业县、北海市合浦县设立三处监控点并对监控点采集的传播媒介样品进行鉴定。共鉴定出7个库蠓品种,除已报道过的尖喙库蠓、肩宏库蠓、荒川库蠓、异域库蠓,还新发现了淡角库蠓、光胸库蠓和无害库蠓。其中尖喙库蠓、荒川库蠓、异域库蠓为已知的BTV传播媒介。对监控点采集的2015年10-11月份哨兵动物的100份肝素钠抗凝血进行病毒分离,以鸡胚接种(E)、 BHK 21细胞传代(B)、C6/36细胞传代(A)三种途径共分离得到23株病毒。通过AC-ELISA及qPCR方法鉴定,其中18株为BTV。通过微量病毒中和试验及病毒型特异性基因VP2扩增确定分离毒株的血清型。目前已确定5株病毒分属3个血清型,除一株为羊源BTV-16外,其余4株为牛源毒株,包括BTV-1、BTV-21各一株,BTV-16二株。对上述毒株的VP2、VP7和NS3/NS3A三个基因节段进行遗传进化分析,发现广西分离株的上述基因大部分属于BTV东方亚群,与日本、印度株同源性高。但来自羊源BTV-16的VP7节段却属于西方亚群,提示,该毒株的基因组可能发生分子重配,该片段或许来自外来毒株。选取牛源BTV-16型毒株人工感染牛与猪,对其致病性进行初步研究。攻毒8天后,实验牛仅观察到鼻黏膜充血,剖检仅见咽喉黏膜充血,睾丸有出血点等轻微病变,未观察到舌发绀,口腔溃疡,肺充血、水肿等BT典型症状; qPCR检测显示,外周血液中的病毒含量最高,其次是肺脏和脾脏,病毒的体内分布与早前报道一致。而在40天的试验周期内,试验猪各组织器官中均未检出BTV核酸,表明分离毒株在猪体内不增殖。
【关键词】：蓝舌病毒 中和试验 病原分离 病毒鉴定 动物攻毒试验
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 常用缩写词9-14
• 第一章 文献综述14-24
• 1.1 BTV及其与机体相互作用14-18
• 1.1.1 BTV的病原学14-17
• 1.1.2 BTV与机体的相互作用17-18
• 1.2 BTV的流行态势18-19
• 1.2.1 BT的世界性分布18-19
• 1.2.2 BTV媒介的分布研究19
• 1.2.3 BT在中国的流行19
• 1.3 BT的诊断与防控19-23
• 1.3.1 BT的诊断19-21
• 1.3.2 BT防控21-23
• 1.4 研究目的23-24
• 第二章 广西地区BTV感染及传播媒介调查24-47
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 反刍动物血清样品来源24
• 2.1.2 广西虫媒病监控点建立及媒介昆虫样品的采集24-25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 主要仪器25-26
• 2.2 方法26-31
• 2.2.1 技术路线26
• 2.2.2 广西BTV血清型调查26-28
• 2.2.2.1 C-ELISA方法筛选BTV阳性血清26-27
• 2.2.2.2 标准毒株的准备27-28
• 2.2.2.3 微量细胞中和试验检28
• 2.2.3 媒介昆虫调查28-31
• 2.2.3.1 监控点库蠓形态学鉴定29-30
• 2.2.3.2 库蠓线粒体基因的扩增30-31
• 2.2.3.3 监控点库蠓种类分析与统计31
• 2.3 结果31-45
• 2.3.1 BTV血清学调查结果31-38
• 2.3.1.1 广西BTV阳性血清筛查结果31-33
• 2.3.1.2 广西BTV的血清型的检测结果33-36
• 2.3.1.3 BTV血清型气候因素及分布地域差异分析36-38
• 2.3.4 媒介昆虫调查结果38-45
• 2.3.4.1 库蠓翅膀形态学观察38-43
• 2.3.4.2 库蠓线粒体基因的序列比对43-44
• 2.3.4.3 监控点库蠓种类分析44-45
• 2.4 讨论45-47
• 第三章 病毒分离与鉴定47-87
• 3.1 材料47-48
• 3.1.1 血液样本47
• 3.1.2 媒介昆虫样本47
• 3.1.3 实验材料47-48
• 3.1.4 实验仪器48
• 3.2 方法48-60
• 3.2.1 技术路线48
• 3.2.2 病毒分离48-50
• 3.2.2.1 媒介昆虫(库蠓、伊蚊)携带病毒的细胞接种分离48
• 3.2.2.2 哨兵动物血液中病毒的细胞接种分离培养48-50
• 3.2.2.2.1 细胞接种分离病毒48-49
• 3.2.2.2.2 鸡胚-细胞接种分离法49-50
• 3.2.3 分离病毒的鉴定50-52
• 3.2.3.1 分离病毒AC-ELISA鉴定50
• 3.2.3.2 分离病毒的Real-Time PCR鉴定50-52
• 3.2.4 分离毒株TCID_(50)的测定52-53
• 3.2.5 分离病毒血清型鉴定53-56
• 3.2.5.1 病毒中和试验确定分离毒株血清型53
• 3.2.5.2 扩增BTV-VP2确定分离毒株血清型53-56
• 3.2.6 分离BTV的VP7与NS3/3A基因序列的扩增56-58
• 3.2.7 dsRNA病毒检测58-60
• 3.2.7.1 总RNA提取58-59
• 3.2.7.2 dsRNA的纯化59
• 3.2.7.3 dsRNA电泳59
• 3.2.7.4 八种虫媒病毒鉴定59-60
• 3.2.8 病毒序列分析60
• 3.3 结果60-85
• 3.3.1 媒介昆虫携带病毒的细胞接种分离60-62
• 3.3.2 监控点哨兵动物病毒的分离62-67
• 3.3.2.1 哨兵动物血液病毒细胞途径分离结果62-65
• 3.3.2.2 哨兵动物血液病毒鸡胚-细胞途径分离结果65-67
• 3.3.3 分离病毒的鉴定结果67-68
• 3.3.3.1 AC-ELISA鉴定结果67
• 3.3.3.2 Real-Time PCR鉴定结果67-68
• 3.3.4 分离病毒的TCID_(50)测定68-69
• 3.3.5 分离病毒的血清型鉴定结果69-71
• 3.3.5.1 分离毒株的病毒中和试验结果69
• 3.3.5.2 BTV的VP2基因扩增结果69-71
• 3.3.6 dsRNA病毒的电泳鉴定结果71-72
• 3.3.7 分离BTV的VP7、NS3/NS3A扩增结果72-73
• 3.3.7.1 BTV的VP7基因扩增结果72-73
• 3.3.7.2 BTV的NS3/NS3A基因扩增结果73
• 3.3.8 分离BTV的VP2、VP7、NS3/NS3A序列分析73-85
• 3.3.8.1 BTV的VP2序列分析73-79
• 3.3.8.2 BTV的VP7序列分析79-80
• 3.3.8.3 BTV的NS3/NS3A序列分析80-85
• 3.4 讨论85-87
• 第四章 动物攻毒实验87-95
• 4.1 材料87
• 4.1.1 实验动物87
• 4.1.2 实验材料87
• 4.1.3 实验仪器87
• 4.2 方法87-89
• 4.2.1 技术路线87
• 4.2.2 分离毒株(牛血毒)回归实验87-88
• 4.2.3 攻毒牛临床症状及病理剖解变化观察88
• 4.2.4 攻毒牛组织脏器中BTV增殖情况的测定88
• 4.2.5 攻毒牛血清抗体水平及毒血症的检测情况88
• 4.2.6 鸡胚致死实验88
• 4.2.7 BTV感染猪的实验88-89
• 4.3 结果89-93
• 4.3.1 血毒回归Real-Time PCR检测血液中病毒核酸含量89-90
• 4.3.2 攻毒牛血清抗体水平及毒血症变化情况90
• 4.3.3 攻毒牛外周血及各组织脏器BTV核酸含量的测定90-91
• 4.3.4 测血毒毒价91
• 4.3.5 鸡胚致死实验91-92
• 4.3.6 猪感染实验92-93
• 4.4 讨论93-95
• 第五章 全文总结95-96
• 参考文献96-109
• 附录1109-110
• 附录2110-129
• 致谢129-130
• 在读期间发表论文情况130

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：1108486