IFN-γ诱导的犬免疫相关GTP酶在弓形虫感染中的作用

发布时间：2017-10-28 22:32

  本文关键词：IFN-γ诱导的犬免疫相关GTP酶在弓形虫感染中的作用

  更多相关文章： 免疫相关GTP酶M 鸟苷酸结合蛋白 纳虫空泡 弓形虫 CRISPR/Cas9

【摘要】：弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,可引起弓形虫病。全球约有三分之一的人感染有弓形虫,我国感染率约为5%-10%。弓形虫为躲避宿主免疫系统的杀伤作用,会寄生在宿主免疫系统难以覆盖的器官,例如通过血脑屏障入侵动物或人的大脑中引起神经症状或者记忆衰退;越过血眼屏障引起视力障碍;也能通过血胎屏障导致人和动物的流产。目前尚无有效的疫苗预防该病,因此弓形虫病严重威胁人类健康和畜牧业的发展。弓形虫在侵入宿主细胞形成不与宿主细胞内膜系统相融合的纳虫空泡膜,其在保护弓形虫体免受宿主细胞内天然免疫系统的杀伤过程中起着非常重要的作用。另外,有研究表明病原体侵入宿主机体后会诱导动物细胞产生包括促炎性细胞因子和干扰素在内的大量天然免疫分子的表达。炎性细胞因子可增加血管通透性,提高吞噬细胞和免疫因子对弓形虫的杀伤作用。在小鼠中,干扰素可通过作用于细胞表面受体诱导大量内源性天然免疫蛋白的表达,其中在抵御弓形虫感染中发挥主力作用的是免疫相关GTP酶(IRGs)和鸟苷酸结合蛋白(GBPs),它们能够在Irgms的“引导”下定位到纳虫空泡膜上,形成类似“攻膜复合体”的结构,使得弓形虫纳虫空泡膜发生囊泡化,进而被破坏,迫使其包裹的弓形虫被释放并为宿主细胞内的天然分子所消灭和清除。本研究旨在探究犬中的IRGs是否在抵御弓形虫感染中也发挥着重要的作用。首先,通过将IRGM4、IRGM5及IRGM6与GST标签蛋白融合进行原核表达,制备出重组蛋白,免疫小鼠分别制备出抗IRGM4、IRGM5以及IRGM6的特异性多克隆抗体以进行IRGM4、IRGM5及IRGM6的内源性表达的检测。然后,设计出特异性针对IRGM4、IRGM5及IRGM6的正向和反向gRNA,将其与Cas9同时转染MDCK中,建立以上三个基因缺失的细胞系,并应用Western blot方法对基因缺失状况进行验证。最后,通过IRGM4ko、IRGM5ko、IRGM6ko和正常的MDCK细胞在IFNγ诱导和未诱导条件下纳虫空泡内弓形虫生长情况的比较,统计分析犬的IRGMs在抵御弓形虫生长中的作用。本研究表明犬的IRGM4、IRGM5及IRGM6均在抑制纳虫空泡内弓形虫的生长中具有重要的作用。在IFNγ未诱导的情况下,IRGM4、IRGM5及IRGM6三个基因缺失的细胞系与正常MDCK细胞中弓形虫的生长并不存在明显差异。因此,单个IRGM4和IRGM5存在的条件下并未使MDCK细胞具有抵御弓形虫感染的作用,可能的原因是IRGs家族以复合体的形式抵御弓形虫的感染。
【关键词】：免疫相关GTP酶M 鸟苷酸结合蛋白 纳虫空泡 弓形虫 CRISPR/Cas9
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 第一章 引言14-19
• 1.1 干扰素诱导GTP酶家族基因的表达14-15
• 1.2 IRGs的结构与分布15-16
• 1.3 IRGs靶向于病原囊泡16-17
• 1.4 IRGs与病原囊泡的相互作用17
• 1.5 本研究的主要内容17-19
• 第二章 IRGM4、IRGM5和IRGM6抗体的制备19-25
• 2.1 材料与方法19-21
• 2.1.1 主要试剂和细胞系19
• 2.1.2 MDCK细胞的体外培养19
• 2.1.3 IRGM4、IRGM5和IRGM6原核表达引物的设计19-20
• 2.1.4 颗粒性抗原的制备20
• 2.1.5 可溶性融合抗原的制备20-21
• 2.1.6 抗IRGMs抗体的制备21
• 2.1.7 内源性IRGMs的表达的检测21
• 2.2 结果21-23
• 2.2.1 IRGM4、IRGM5以及IRGM6序列分析21
• 2.2.2 GST与IRGM4、IRGM5和IRGM6融合表蛋白的制备21-22
• 2.2.3 内源性IRGM4、IRGM5和IRGM6表达的检测22-23
• 2.3 讨论23-25
• 第三章 IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除细胞系的建立25-33
• 3.1 材料与方法25-28
• 3.1.1 主要试剂25
• 3.1.2 gRNA的选择25-26
• 3.1.3 sgRNA的构建26-27
• 3.1.4 MDCK细胞的转染与敲除27
• 3.1.5 IRGM6基因缺失细胞系的建立27-28
• 3.1.6 IRGM4和IRGM5的基因敲除细胞系的的建立28
• 3.1.7 基因缺失细胞系的鉴定28
• 3.2 结果28-31
• 3.2.1 IRGM4、IRGM5以及IRGM6的基因编辑28-30
• 3.2.2 IRGM4、IRGM5以及IRGM6基因缺失的western blot鉴定30-31
• 3.3 讨论31-33
• 第四章 IRGMS在抗弓形虫中的作用33-42
• 4.1 材料与方法34
• 4.1.1 主要材料、弓形虫株和细胞系34
• 4.1.2 弓形虫感染和纳虫空泡内弓形虫数比较的试验方法34
• 4.1.3 弓形虫的体外培养34
• 4.2 结果34-40
• 4.2.1 IFNγ诱导和未诱导MDCK细胞对弓形虫生长的作用35-36
• 4.2.2 在未经IFNγ诱导的条件下IRGMs基因缺失细胞系对弓形虫生长的作用36-38
• 4.2.3 在经IFNγ诱导的条件下IRGMs基因缺失细胞系对弓形虫生长的作用38-40
• 4.3 讨论40-42
• 第五章 结论42-44
• 5.1 全文总结42
• 5.2 研究展望42-44
• 参考文献44-49
• 致谢49-50
• 作者简历50

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