广西PRRSV地方流行毒株分子流行病学调查及不同猪群中PRRSV抗体检测分析

发布时间：2017-10-29 07:33

  本文关键词：广西PRRSV地方流行毒株分子流行病学调查及不同猪群中PRRSV抗体检测分析

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)作为一种高度接触性传染病,其病毒高度的变异是猪繁殖与呼吸综合征免疫防控失败的主要制约因素。结构蛋白ORF5和非结构蛋白Nsp2基因是进行PRRSV分子流行病学研究和病毒遗传变异分析的靶基因,对研究蓝耳病毒的ORF5和Nsp2基因有着十分重要的意义。本研究对2012-2015年问送检的样品进行检测分析,通过对ORF5和Nsp2基因序列测定和分析,以及不同猪群中PRRSV抗体水平检测分析,进一步了解广西近年来PRRSV的流行趋势及变异情况,为该病的综合防控提供基础数据和理论依据。(1)本研究通过RT-PCR方法,对疑似感染PRRSV样品进行病原检查分析,共检测到91份阳性样品,阳性率为18.13%。对所获阳性样品进行PRRSV特异性片段扩增,获得18条Nsp2基因序列和48条ORF5基因序列。Nsp2基因序列分析结果显示：18个Nsp2基因与NCBI所收录的部分参考毒株相应核苷酸序列及其推导氨基酸同源性为51.9～99.1%和30.4～98.7%。所获Nsp2推导氨基酸与JXA1株的同源性最高。48个ORF5基因NCBI部分参考毒株相应核苷酸及推导氨基酸的同源性为61.8～99.7%和52.7-99.0%。以ORF5基因为主,结合Nsp2基因进行遗传进化分析,结果表明广西流行的PRRSV毒株分属于美洲型的2个亚群,主要是以JXA1为代表的Ⅳ亚群以及少数以HB-1(sh)/2002株为代表的Ⅲ亚群。氨基酸序列分些结果表明,所获得的18个Nsp2基因中有15个存在与JXA1株一样位置的30个不连续氨基酸的缺失。与VR-2332毒株相比,ORF5编码的GP5蛋白中出现大量氨基酸的突变,特别是在B细胞表位的中和抗原表位(PNE)、T细胞表位以及潜在糖基化位点。与广西过去10年NCBI所收录部分参考毒株(89株)相比,自2012年以来,氨基酸位点突变率明显提高,主要集中在氨基酸位点R151K(18/48,突变率37.5%)；E170Q(14/48,突变率29.17%)；V185A(48/48,突变率100%)；Q196R/L(33/48,突变率68.75%)。而与之相比,参考毒株89株中发生突变的氨基酸R151→K151(2/89,突变率为2.24%)；E170Q(9/89,突变率10.11%)；V185A(63/89,突变率70.78%)；Q196R/L(7/89,突变率7.86%)。推测这些位点的突变将是今后广西流行毒株突变的一个趋势。且这些突变导致的蛋白内在结构变化、糖基位点的缺失可能会影响中和抗体产生的速度与数量。结合进化树分析结果,亲缘关系与NCDA30毒株最近的三个毒株GXBS120815. GXYL130617. GXYL 130624氨基酸位点151、170、189、191、192等突变方向与NADC30株的突变方向一致,表明广西存在NADC30-like毒株流行,推测可能与NADC30株来源于同一株,且特定位点突变方向可以作为参考毒株是否与NCDA30毒株源于同一毒株的参考性指标。(2)为研究免疫压力下PRRSV免疫情况,对广西某地区2014-201 5年春秋两季在养殖场、散养户、屠宰场等采集的2228份血清进行PRRSV抗体及部分样品病原检测。依据猪群养殖规模及来源分类,本研究获得PRRSV抗体阳性样品为1698份,阳性率为76.21%,S/P值2.5的比例占8.66%；规模种猪场及500头以上的规模养殖场,阳性率最高达92.5%,S/P值2.5的最低比例为2.03%。散养户抗体合格率最低,阳性率为51-31-68.42%,免疫效果最差,S/P值2.5的比例高达16.28%。研究表明某地区种猪场及中大型规模养殖场猪群比较稳定,免疫效果最好,而散养户猪群免疫效果最差且不稳定,存在野毒感染的风险。依据猪群年龄、性别、用途分类,采集2228份的血清进行PRRSV抗体,结果获得PRRSV抗体阳性样品为1648份,阳性率为73.97%,S/P值2.5比例为8.59%。猪群公猪的免疫效果最好,阳性率83.33-94.44%,S/P值在1.38～1.44,S/P位2.5最高比例2.32%。保育猪抗体阳性率为66.07-70.05%,S/P值2.5比例最低为13.53%。数据分析表明种猪群处于最稳定状态,不同群体之间抗体水平参差不齐,整体猪群虽较为稳定,但野毒感染风险较大。分析不同疫苗厂家免疫PRRSV抗体情况表明,不同厂家疫苗免疫效果差异显著,2014～2015年政府采购疫苗抗体阳性率分别为71.81～82.32%,73.15～88.55%,总阳性率为79.27%。非政府采购疫苗抗体阳性率分别为79.22%～89.91%,83.11～91.60%,总阳性率为83.17%。2014～2015年弱毒疫苗抗体阳性率85.4%,87.23%,灭活苗抗体阳性率73.33%,76.68%,PRRS弱毒疫苗免疫效果要优于灭活疫苗。此外,对广西某地区送检的55份样品中,获得11条ORF5基因序列,序列同源性及遗传进化分析表明,11株均为美洲型毒株,与JXA1株同源性最高,提示某地区主要以JXA1株为代表的高致病性蓝耳病的Ⅳ亚群,及仅少数分布于HB-1(sh)/2002为代表的Ⅲ亚群在流行,与整个广西地区流行的PRRS趋势一致。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征病毒 分子流行病学 序列分析 抗体检测
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 缩略词表11-15
• 第一章 综述15-31
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征简介15
• 1.2 PRRSV的病原学研究15-17
• 1.2.1 病毒属性15-16
• 1.2.2 病毒生物学特性16-17
• 1.3 PRRSV基因结构17-23
• 1.3.1 基因组结构17-19
• 1.3.2 各基因组编码的蛋白及功能19-23
• 1.4 我国PRRS流行情况23-24
• 1.5 基因的多样性和变异性24-26
• 1.6 PRRS抗体的概述26-28
• 1.6.1 天然免疫26
• 1.6.2 体液免疫26-27
• 1.6.3 细胞免疫27-28
• 1.7 PRRSV诊断方法28-29
• 1.7.1 血清学诊断方法28-29
• 1.7.2 分子生物学诊断方法29
• 1.8 研究目的和意义29-30
• 1.9 技术路线30-31
• 第二章 2012～2015年广西地区PRRSV分子流行病学调查31-86
• 2.1 材料31-35
• 2.1.1 实验主要仪器设备31
• 2.1.2 主要试剂及菌株31
• 2.1.3 常用试剂的配制31-32
• 2.1.4 引物设计32-33
• 2.1.5 生物学软件33
• 2.1.6 国内外参考序列33-35
• 2.2 方法35-40
• 2.2.1 病料等样品处理35-36
• 2.2.2 病毒RNA的提取36
• 2.2.3 PRRSV RT-PCR的检测36-37
• 2.2.4 Nsp2基因及ORF5基因扩增、测序与分析37-40
• 2.3 结果与分析40-81
• 2.3.1 PRRSV流行毒株RT-PCR检测结果40-42
• 2.3.2 PRRSV特异片段Nsp2及ORF5基因的扩增结果42-43
• 2.3.3 流行毒株Nsp2基因序列分析43-49
• 2.3.4 流行毒株ORF5基因序列分析49-64
• 2.3.5 本研究流行毒株与广西2004～2015年部分毒株对比分析64-81
• 2.4 讨论与分析81-86
• 2.4.1 广西PRRSV的流行情况81
• 2.4.2 Nsp2基因变异分析81-82
• 2.4.3 ORF5基因变异分析82-86
• 第三章 猪群中PRRSV抗体检测分析86-103
• 3.1 实验材料86-87
• 3.1.1 主要实验设备86
• 3.1.2 主要实验试剂86
• 3.1.3 猪群的选定86-87
• 3.1.4 生物学软件87
• 3.1.5 引物设计87
• 3.2 实验方法87-88
• 3.2.1 血清样品及组织病料的采集87
• 3.2.2 猪群血清PRRSV抗体检测87
• 3.2.3 病料样品处理87-88
• 3.2.4 样品病毒RNA的提取88
• 3.2.5 PRRSV RT-PCR的检测88
• 3.3 实验结果88-99
• 3.3.1 猪群血清PRRSV抗体检测结果分析88-93
• 3.3.2 不同疫苗厂家猪群血清PRRSV抗体检测结果分析93-95
• 3.3.3 血清及病料样品的RT-PCR检测95-96
• 3.3.4 ORF5基因的扩增96
• 3.3.5 ORF5基因序列分析96-99
• 3.4 讨论与分析99-103
• 3.4.1 不同猪群中抗体水平分析99-100
• 3.4.2 不同疫苗厂家所产生抗体水平分析100-101
• 3.4.3 猪群中分子病原学分析101
• 3.4.4 PRRS防控101-103
• 第四章 全文结论103-104
• 参考文献104-116
• 致谢116-117
• 攻读学位期间发表论文情况117

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