宠物源肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行特征及其分子传播机制研究

发布时间：2017-10-30 14:00

  本文关键词：宠物源肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行特征及其分子传播机制研究

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【摘要】：氨基糖苷类药物是最早被发现并投入到临床应用中的抗生素之一,尽管其重要性曾一度由于一些副作用较少的广谱抗菌药的推出而有所削弱,时至今日,随着多重耐药细菌感染率的急剧升高,氨基糖甙类抗生素作为屈指可数的可用治疗选择之一,重新获得了人们的广泛关注。然而,也正因为氨基糖苷类药物的广泛应用,近些年来,国内外关于细菌对氨基糖苷类抗生素耐药情况日趋严重的报道日渐增多,可使细菌对其产生耐药性的机制种类众多,其中以产生16S rRNA甲基化酶这种机制所导致的耐药程度最高(通常MIC512mg/L),它可介导对大多数的临床重要氨基糖苷类,如阿贝卡星,庆大霉素,妥布霉素和阿米卡星等药物的耐药,并且可以通过质粒、转座子、整合子等可移动元件在不同菌种和物种间进行传播。宠物作为人类最亲密的伙伴,它们和人类健康的相互关联性不言自明,本文旨在了解我国宠物临床中16S r RNA甲基化酶基因流行性,进一步研究其遗传特征和传播机制,为兽医临床上合理利用氨基糖苷类药物并延缓其耐药发展速度以及减小耐药的程度打下理论基础,同时希望能以此为依据来促进有效遏制宠物源16S rRNA甲基化酶基因向人类传播的措施的制定,对解决由此引发的人类的公共卫生问题起到一定的协助作用。1、宠物源肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因流行情况本研究以从广东省多个动物医院在2008、2009、2010、2012年间收集的381株肠杆菌(大肠杆菌343株,肺炎克雷伯菌30株,奇异变形杆菌6株,阴沟肠杆菌2株)为研究对象,用含有庆大霉素和阿米卡星的药板初步筛选出具有耐药表型的菌株77株,通过PCR以及测序的方法检测16S rRNA甲基化酶基因(armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,rmtE,rmtF,rmtG和npmA),分析不同分离时间肠杆菌的耐药状况以及16S rRNA甲基化酶基因的流行情况。结果发现:在381株受试肠杆菌中,61(16.01%,61/381)株携带有rmtB基因,4(1.05%,4/381)株携带armA基因,2(0.52%,2/381)株同时携带rmtB、armA两种基因,未检出其它16S rRNA甲基化酶基因。采用琼脂二倍稀释法检测了77株对阿米卡星和庆大霉素有耐药表型的菌株对兽医临床常用几类抗菌药物:氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类、酰胺醇类、四环素类和磺胺类的14种抗菌药的敏感性。统计结果可知,这些肠杆菌对四环素、庆大霉素、磺胺甲VA唑/甲氧苄啶、氨苄西林、卡那霉素耐药率达90%以上,对头孢噻肟、诺氟沙星、氟苯尼考、环丙沙星、氯霉素、链霉素、阿米卡星、新霉素的耐药率在50%~90%之间;对安普霉素耐药的细菌比重则低于50%。耐药率最高的前五种抗生素分别是四环素(98.70%)、氨苄西林(97.40%)、磺胺甲VA唑/甲氧苄啶(96.10%)、庆大霉素(94.81%)和卡那霉素(94.81%)。77株肠杆菌产生耐药率最低的三种药物分别是安普霉素(41.56%)、氟苯尼考(53.25%)和头孢噻肟(55.84%)。对剩下的6种抗菌药物耐药率范围在70.13%至89.61%之间。这些数据充分说明,宠物源产16S rRNA甲基化酶的肠杆菌多重耐药情况十分严重。2、16S rRNA甲基化酶基因的传播机制运用脉冲场凝胶电泳(pulsedfield gel electrophoresis,PFGE)、接合转移实验、接合子质粒限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)以及S1-PFGE和Southern blot等方法从垂直传播和水平传播两方面来研究16S rRNA甲基化酶基因的传播机制。PFGE结果表明16S rRNA甲基化酶阳性大肠杆菌之间的亲缘关系较远,而分离自同一宠物医院的肺炎克雷伯菌株的PFGE分型相似则提示存在菌株克隆传播现象。通过接合转移实验证明了16S rRNA甲基化酶基因的可转移性,且在部分菌株中blaCTX-M能随rmtB一同转移到受体菌中。在大肠杆菌中,rmtB位于60kb~194kb左右的大小不同的IncF33或IncF2型质粒上,在肺炎克雷伯菌中,rmtB均位于~97kb的IncF33的质粒上。对接合子质粒进行EcoRI酶切,发现部分具有相同复制子分型的质粒酶切条带相同或相似,有的酶切谱型相似的质粒分别来自大肠杆菌和肺炎克雷伯菌,说明携带16S rRNA甲基化酶基因的质粒可能存在菌种间的传播,而IncF型质粒是促进16S rRNA甲基化酶耐药基因在宠物源菌株间水平传播、快速扩散的主要载体。在广州宠物源肠杆菌中,16S r RNA甲基化酶基因的存在比较普遍,且以rmtB基因型为主,armA基因型偶发。本研究中的大肠杆菌16S rRNA甲基化酶阳性菌中rmtB基因位于~60kb至~194kb的IncF型接合性质粒上,且存在部分的质粒在菌种间传播的现象;垂直克隆传播和水平传播共同造成了16S rRNA甲基化酶基因在肺炎克雷伯菌中的流行。rmtB阳性菌中广泛存在CTX-M型超广谱β-内酰胺酶,并能与rmtB基因一起进行接合传播,介导细菌同时对氨基糖苷类和β-内酰胺类药物的耐药性。现如今,宠物社会地位的提高使得人类和他们的宠物之间有了更频繁而密切的身体接触(例如,通过共享生活空间)并创造了人类和宠物交换微生物的机会,此外,抗菌药物的使用增加了对微生物的选择性压力,使得耐药性迅速发展。
【关键词】：宠物 肠杆菌 16S rRNA甲基化酶 质粒
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 前言12-18
• 1.1 细菌耐药机制简介12-15
• 1.2 氨基糖苷类药物耐药性及 16S rRNA甲基化酶的发现历程15-17
• 1.3 16S rRNA甲基化酶特征及流行现状17-18
• 2 材料与方法18-41
• 2.1 材料18-23
• 2.1.1 受试菌株18
• 2.1.2 培养基18-19
• 2.1.3 主要试剂19
• 2.1.4 主要溶液的配制19-22
• 2.1.5 主要仪器与设备22
• 2.1.6 药物22-23
• 2.2 方法23-41
• 2.2.1 细菌的复苏、鉴定与保存23-24
• 2.2.2 耐药表型的筛选24
• 2.2.3 16S rRNA甲基化酶基因的检测24-25
• 2.2.4 16S rRNA甲基化酶阳性菌对14种抗菌药的敏感性实验25-26
• 2.2.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE）26-29
• 2.2.6 接合转移29-30
• 2.2.7 接合子ESBLs基因检测及鉴定30-32
• 2.2.8 接合子质粒复制子分型32-34
• 2.2.9 质粒抽提34-36
• 2.2.10 接合子质粒的酶切分析36
• 2.2.11 S1-PFGE36-39
• 2.2.12 Southern杂交39-41
• 3 结果与分析41-53
• 3.1 细菌的复苏和鉴定结果41-42
• 3.2 阿米卡星-庆大霉素耐药菌株初步筛选42
• 3.3 肠杆菌 16S rRNA甲基化酶基因的检测结果42-44
• 3.4 药敏性测试结果44
• 3.5 PFGE结果44-46
• 3.6 接合转移实验结果46-50
• 3.6.1 筛选接合子的药物浓度46
• 3.6.2 接合实验结果46
• 3.6.3 接合子 16S rRNA甲基化酶基因的PCR检测结果46-47
• 3.6.4 接合子Eric-PCR检测结果47
• 3.6.5 接合子及原菌株的MIC比较47
• 3.6.6 接合子复制子分型结果47-48
• 3.6.7 接合子质粒的酶切分析48-49
• 3.6.8 接合子bla_(TEM-1)，，bla_(CTX-M)基因检测49-50
• 3.7 S1-PFGE和Southern杂交结果50-53
• 4 讨论53-58
• 4.1 宠物源肠杆菌中 16S rRNA甲基化酶的流行情况及其介导的耐药特征53-55
• 4.2 16S rRNA甲基化酶基因和 β-内酰胺酶基因的相关性55-56
• 4.3 16S rRNA甲基化酶基因的传播机制研究56-58
• 全文结论58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：1117884