禽痘病毒对雏鸡皮肤病变的演化及MAPKs通路研究

发布时间：2017-10-31 12:16

  本文关键词：禽痘病毒对雏鸡皮肤病变的演化及MAPKs通路研究

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【摘要】：禽痘是由禽痘病毒(Avian poxvirus,APVs)引起的各个年龄段家禽、鸟类发病以出痘为主要特征的一种传染性疾病。病毒感染后能够导致宿主的死亡,同时容易继发感染,不仅给养殖业带了极大地经济损失,同时对野生鸟类,尤其是濒危鸟类造成极大威胁。本研究通过建立APVs感染鸡动物模型,运用病理学方法,比较了鸡源和野生山斑鸠源APVs的致病性,观察了痘疹的发生发展过程;利用荧光定量PCR技术,测定了感染鸡皮肤组织相关因子的表达量,试图探索APVs致皮肤组织增生的机制。1.APV-P4b多克隆抗体的制备本实验以APVs的DNA为模板,利用PCR方法扩增P4b基因,克隆至pET42b载体上,经NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定,测序分析正确后,获得重组质粒pET42b-APV-P4b,转化至大肠杆菌Rosetta中,在IPTG终浓度0.1mmol/L和37℃条件下诱导6h,外源基因获得高效表达。通过Ni-NTA对蛋白进行纯化,纯化后的APV-P4b蛋白免疫家兔,经三次免疫后选择血清效价最高的兔子,取全血,分离得到APV-P4b多克隆抗体,经免疫组织化学方法检测,结果表明多克隆抗体可特异性识别APVs。2.雏鸡感染模型的建立用来源于鸡和野生山斑鸠的APVs,分别命名为HN-1210毒株和HN-1308毒株,分别感染10日龄白来航蛋鸡,在感染后6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h剖杀取皮肤组织,通过组织病理学观察APVs感染皮肤后痘疹的发生发展过程及APVs在皮肤组织中的分布;利用RT-qPCR技术检测APVs感染后皮肤组织中EGFR、Raf和Cyclin D1表达量的动态变化,探讨APVs引起皮肤上皮细胞增生的机制。临床症状结果发现,HN-1210毒株感染后2d出现少量白色痘疹,感染3d后痘疹数量明显增多,感染5d后痘疹出现破溃的现象,形成痘痂同时伴有出血,感染后7d发生痘痂脱落。HN-1308毒株感染后5d在接种部位出现少量暗红色的痘疹,感染后7d未发现病变有进一步加重的现象。组织病理学观察可见,HN-1210感染后2d毛囊和表皮层的上皮细胞增生,细胞数量明显增多,感染后3d毛囊上皮细胞出现水泡变性,在细胞质中可以观察到有嗜酸性包涵体的存在,而表皮层无水泡变性及嗜酸性包涵体出现,感染5d后,表皮层上皮细胞出现水泡变性及细胞质中观察到嗜酸性包涵体,同时一些区域的角质层结构的完整性破坏,伴有明显的出血现象,感染7d后表皮层与真皮层脱离,同时伴有大面积的出血。HN-1308毒株感染5d和7d后,在真皮层以毛囊为中心有大量的淋巴细胞增生,伴随有毛囊炎的发生,毛囊结构完全消失,被嗜伊红性均质物所取代,表皮层组织结构完整,未见有增生现象。用免疫组织化学定位病毒抗原,结果显示:阳性信号存在于毛囊和上皮细胞的细胞质,提示APVs感染后主要存在于上皮细胞的细胞质中。荧光定量检测皮肤中EGFR介导的增生信号通路相关因子的表达量,结果显示HN-1210毒株感染后EGFR的表达量在1d到5d处于上调状态,感染后3d达到最高值;Raf表达量在1d到7d均处于上调状态;Cyclin D1表达量在2d到7d处于上调的状态,可见EGFR信号被激活后经由Ras-Raf-ERK/MAPK通路传导入核,使Cyclin D1的表达量增加,缩短细胞周期,促进细胞增生。HN-1308毒株感染后EGFR表达量在24h有上升的趋势,之后趋于正常水平,Raf和Cyclin D1在感染过程中表达量处于正常水平,说明EGFR介导的增生通路未被激活。
【关键词】：禽痘 痘疹 水泡变性 包涵体 增生 EGFR
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略语表(Abbreviation)11-12
• 前言12-20
• 1. 禽痘病毒的致病性及疾病诊断12-15
• 1.1 宿主13
• 1.2 传播途径13
• 1.3 临床症状13-14
• 1.4 实验室诊断14-15
• 2. APVs分子生物学特性15-17
• 2.1 APVs基因组结构15
• 2.2 APVs的分类15-16
• 2.3 APVs系统发育进化分析16-17
• 3 细胞增生信号通路研究17-20
• 3.1 EGF和EGFR17-18
• 3.2 MAPK信号通路18
• 3.3 重要的细胞周期调节蛋白Cyclin D118-20
• 研究目的及意义20-21
• 材料与方法21-35
• 1 试验材料21-25
• 1.1 主要仪器设备21
• 1.2 主要试剂21-22
• 1.3 主要试剂的配制22-23
• 1.4 病毒来源23-24
• 1.5 实验动物24
• 1.6 实验所用引物24-25
• 2 试验方法25-35
• 2.1 病毒的增殖25
• 2.2 EID50的测定25
• 2.3 APV-P4b蛋白的表达与纯化25-30
• 2.4 多克隆抗体的制备30
• 2.5 免疫组织化学技术检测多克隆抗体30-31
• 2.6 动物试验31
• 2.7 不同组织中病毒的检测—PCR31
• 2.8 皮肤组织病理学变化动态观察31-32
• 2.9 APVs在皮肤组织中的分布与定位--免疫组织化学方法32
• 2.10 皮肤组织中EGFR、RAF、Cyclin D1基因表达量的测定  实时荧光定量PCR32-35
• 结果35-55
• 1. APV-P4b蛋白的表达与纯化35-37
• 1.1 PCR扩增目的片段35
• 1.2 原核表达蛋白APV-P4b的SDS-PAGE鉴定35-37
• 2 多克隆抗体的制备37-38
• 2.1 免疫兔血清抗体效价的检测37
• 2.2 免疫组化检测多克隆抗体结果37-38
• 3 鸡胚接种结果38-41
• 3.1 CAM组织学观察结果38-40
• 3.2 EID50测定结果40-41
• 4.动物实验结果41-55
• 4.1 不同组织中病毒检测--PCR检测结果41
• 4.2 HN-1210和HN-1308株APV感染雏鸡的临床表现与眼观病变41-44
• 4.3 HN-1210和HN-1308株APV感染雏鸡的组织病理学变化结果44-48
• 4.4 APV在皮肤组织中的分布  免疫组织化学技术检测结果48-50
• 4.5 皮肤组织中EGFR、Raf、CyclinD1的mRNA表达量测定  RT-qPCR检测结果50-55
• 讨论55-58
• 1 HN-1210和HN-1308株APV的增殖55
• 2 动物模型55-56
• 3 免疫组织化学检测56-57
• 4 EGF/EGFR介导的信号通路在APVs感染过程中的作用57-58
• 结论58-59
• 参考文献59-65
• 致谢65

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