水貂肠炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条的研制

发布时间：2017-10-31 16:07

  本文关键词：水貂肠炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条的研制

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【摘要】：水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)是由水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起的一种急性传染病。自然条件下主要特性为剧烈腹泻,幼龄水貂具有较高的发病率和死亡率。随着世界毛皮动物饲养业的快速发展,水貂病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖业三大疫病之一,给全世界养貂业带来巨大的经济损失。免疫胶体金层析技术(Gold immunochromatography assay,GICA)是免疫层析技术、胶体金标记技术及免疫反应的结合体。胶体金是一种常用的标记技术,以胶体金作为标志物应用抗原、抗体检测的一种新型的检测方法,具有简单快速、结果清晰,可通过肉眼观察、灵敏度高、无污染和携带方便等优点。因此该技术得到了迅速发展,在兽医学领域应用也越来越多。本研究采用竞争法建立检测MEV胶体金试纸条,柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金颗粒与抗MEV单克隆抗体合成金标探针。纯化的MEV VP2蛋白包被在NC膜上作为检测线(T线),羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为质控线(C线),组装成胶体金层析试纸条。根据水貂肠炎病毒MEVB毒株,设计特异性引物扩增MEV VP2结构蛋白基因获得1 773 bp基因片段;将该基因片段连接到克隆载体上,验证正确后定向连接到原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),重组质粒经酶切和测序鉴定正确后进行诱导表达。IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果发现该蛋白在37?C,诱导剂IPTG终浓度为1.0 mmol/L条件下良好表达,鉴定该重组MEV VP2蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 KD,用镍柱纯化后获得较纯的融合蛋白。采用蔗糖密度梯度超速离心法纯化MEVB细胞培养物。经纯化的MEVB毒株免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法的筛选,获得6株能稳定分泌抗MEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4、6、8、10、13、14。该6株单克隆抗体分别进行了腹水效价测定,结果为单抗4和13抗体效价为1.28×105,单抗6和14抗体效价为2.56×105,单抗8和10抗体效价为5.12×105;特异性试验鉴定该6株单克隆抗体能与犬细小病毒(CPV)及水貂肠炎病毒(MEV)呈阳性反应,但不与犬瘟热病毒(CDV)、水貂阿留申病毒(AMDV)及犬腺病毒(CAV)发生反应;经亚型鉴定,其中单抗4、10为IgG2b亚型、单抗6为IgG1亚型,单抗8、13、14为IgG2a亚型;间接免疫荧光鉴定该6株单克隆抗体均能使接毒的F81细胞产生绿色荧光;免疫印迹试验结果显示该6株单克隆抗体可在约70 KD处出现特异性反应条带。本试验为MEV的深入研究、快速诊断方法的建立奠定了基础。采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,与抗MEV单克隆抗体10偶联形成金标探针。优化最佳试纸条各项参数,将MEV VP2蛋白以0.8 mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线(T线),将羊抗鼠IgG以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线(C线)。该胶体金检测试纸条的敏感性为1:64。该试纸条检测MEV和CPV样品为阳性结果,而对CDV、CAV和AMDV等相关病毒样品检测均为阴性结果,说明该试纸条特异性良好。与CPV胶体金试纸条方法符合率可达到94.1%。在4?C和25?C条件下可以保存6个月其敏感性和特异性没有明显的变化。本研究成功的建立检测MEV胶体金试纸条,为早期诊断、预防和控制MEV具有重要的现实意义。
【关键词】：水貂肠炎病毒 VP2蛋白 单克隆抗体 免疫胶体金试纸条
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 第一章 文献综述13-22
• 1.1 水貂肠炎病毒13-18
• 1.1.1 生物学特性13-14
• 1.1.2 基因组结构14-15
• 1.1.3 遗传进化15-16
• 1.1.4 转铁蛋白受体16-17
• 1.1.5 疫苗研究17-18
• 1.1.6 诊断方法18
• 1.2 免疫胶体金层析技术18-20
• 1.2.1 免疫胶体金技术简介18-19
• 1.2.2 胶体金技术的优点及不足19
• 1.2.3 胶体金免疫层析技术的应用19-20
• 1.3 研究目的和意义20-22
• 第二章 水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及鉴定22-32
• 2.1 试验材料22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 病毒基因组的提取22-23
• 2.2.2 VP2基因的克隆23-24
• 2.2.3 表达载体的构建与鉴定24-25
• 2.2.4 原核表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达25
• 2.2.5 重组蛋白最佳表达条件的筛选25
• 2.2.6 重组蛋白的变性25-26
• 2.2.7 重组蛋白的纯化26
• 2.2.8 SDS-PAGE分析26
• 2.2.9 重组蛋白的Western blotting鉴定26
• 2.3 结果26-30
• 2.3.1 MEV VP2基因的扩增26-27
• 2.3.2 重组克隆质粒酶切鉴定27
• 2.3.3 重组克隆质粒测序鉴定27
• 2.3.4 重组表达质粒酶切鉴定27-28
• 2.3.5 重组表达质粒测序鉴定28
• 2.3.6 表达产物SDS-PAGE分析28
• 2.3.7 优化目的蛋白可溶性表达28-30
• 2.3.8 重组蛋白Western-blotting鉴定30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 水貂肠炎病毒单克隆抗体的制备32-41
• 3.1 材料32
• 3.1.1 种毒、动物与细胞系32
• 3.1.2 主要试剂和耗材32
• 3.2 方法32-37
• 3.2.1 抗原的制备32-33
• 3.2.2 动物免疫33
• 3.2.3 间接ELISA法检测血清效价33-34
• 3.2.4 杂交瘤细胞株的制备34-35
• 3.2.5 阳性杂交瘤细胞筛选方法的建立35
• 3.2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆（有限稀释法）35
• 3.2.7 McAb大量制备35
• 3.2.8 McAb腹水纯化35-36
• 3.2.9 McAb鉴定36-37
• 3.3 结果37-39
• 3.3.1 抗原的纯化37
• 3.3.2 间接ELISA方法的建立37
• 3.3.3 杂交瘤细胞的融合和筛选37
• 3.3.4 单克隆抗体的特性鉴定37-39
• 3.4 讨论39-40
• 3.4.1 免疫抗原的制备39
• 3.4.2 免疫动物的选择39
• 3.4.3 免疫程序的确定39
• 3.4.4 杂交瘤细胞筛选39
• 3.4.5 杂交瘤细胞亚克隆39-40
• 3.4.6 腹水的制备及纯化40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 水貂肠炎病毒胶体金快速检测试纸条研制41-51
• 4.1 试验材料41
• 4.2 方法41-44
• 4.2.1 单克隆抗体预处理41
• 4.2.2 玻璃器皿酸化和硅化处理41-42
• 4.2.3 20 nm胶体金溶液的制备42
• 4.2.4 胶体金溶液的质量鉴定42
• 4.2.5 免疫胶体金探针制备及其鉴定42-43
• 4.2.6 胶体金试纸条的制备43
• 4.2.7 胶体金检测原理及结果判断43-44
• 4.2.8 试纸条特异性试验44
• 4.2.9 试纸条灵敏度试验44
• 4.2.10 试纸条稳定性试验44
• 4.2.11 胶体金试纸条初步应用44
• 4.3 结果44-49
• 4.3.1 胶体金溶液的制备及鉴定44-45
• 4.3.2 胶体金与抗体结合的最佳pH值确定45-46
• 4.3.3 胶体金与抗体结合的最佳浓度确定46
• 4.3.4 胶体金探针的鉴定46-47
• 4.3.5 硝酸纤维素膜（NC膜）的选择47
• 4.3.6 胶体金试纸条的组装和结果的判定47-48
• 4.3.7 胶体金试纸条性能试验48-49
• 4.3.8 胶体金试纸条初步应用49
• 4.4 讨论49-50
• 4.4.1 胶体金的制备49
• 4.4.2 免疫胶体金探针的制备49-50
• 4.4.3 制备胶体金试纸条耗材的选择50
• 4.5 小结50-51
• 第五章 全文结论51-52
• 参考文献52-58
• 附录58-64
• 致谢64-65
• 作者简历65

【参考文献】

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本文编号：1122778