猪瘟病毒感染报告细胞系和猪圆环病毒2型敏感细胞系的建立

发布时间：2017-10-31 20:17

  本文关键词：猪瘟病毒感染报告细胞系和猪圆环病毒2型敏感细胞系的建立

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【摘要】：猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病,每年给我国养猪业造成的直接经济损失达数十亿元。尽管病毒分离培养是病毒检测的金标准,但该方法耗时过长;分子生物学方法虽然灵敏、耗时短,但容易出现假阳性。病毒感染报告细胞的优点是检测灵敏度高,且可一次分析多个样本,既可用于病毒的检测,也可用于病毒的分离培养,还可以用于高通量筛选抗病毒药物。本研究构建了CSFV感染报告细胞系。首先,在EGFP与淬灭肽中间插入可被CSFVNS3蛋白酶特异识别并切割的保守NS4A/4B序列,构建出报告质粒;然后,将报告质粒稳定转染PK-15细胞,获得CSFV报告细胞系PK-15-CSFV-EGFP;该细胞系在感染CSFV时,与EGFP融合表达的NS4A/4B序列被NS3蛋白酶识别并切割,从而使淬灭肽与EGFP肽分离,EGFP肽构象重排形成成熟的发光团结构,最终发出强烈的绿色荧光。对PK-15-CSFV-EGFP细胞系进行发光检测、灵敏度检测、特异性检测、荧光强度和病毒拷贝数相关性分析和不同细胞系增殖CSFV效果分析。结果表明,在荧光显微镜下,细胞系PK-15-CSFV-EGFP只有在感染CSFV后才能够检测到明显的绿色荧光,而无病毒感染或感染其它猪源病毒时不发出绿色荧光;在48 hpi时荧光强度最强,且细胞荧光强度与CSFV病毒量呈正相关关系;报告细胞系与q PCR灵敏度一致,均优于RT-PCR;CSFV在报告细胞系中的增殖能力与其在ST、PK-15细胞中没有明显的区别。猪圆环病毒2型(PCV2)在PK-15细胞中的复制效率较低,一般都在106-107TCID50/m L左右。PCV DNA复制通常开始于细胞有丝分裂后期,其复制依赖细胞分裂S期合成的相关酶。内源性和外源性的IL-2能直接刺激各类上皮细胞的增殖(由G1期进入S期),且在培养液中加入IL-2,可显著增强PCV2的复制。基于此原理,本研究构建了猪圆环病毒敏感细胞系。首先,从新鲜血液中分离得到淋巴细胞,在淋巴细胞培养液中加入Con A诱导IL-2细胞因子的表达,并克隆猪源IL-2基因;然后,构建稳定表达猪源IL-2的细胞系(PK-15-IL-2)。对PK-15-IL-2进行攻毒实验,结果表明,PK-15-IL-2能够明显促进PCV2复制,连续攻毒后,PCV2拷贝数可到1×1010/m L,病毒TCID50为109-109.5/m L。本研究构建的猪瘟病毒感染报告细胞系和猪圆环病毒敏感细胞系,对病毒的相关研究及疾病预防具有重要意义,在临床检测、科学研究上具有广阔的应用前景。
【关键词】：猪瘟病毒 绿色荧光蛋白 猪圆环病毒 白介素-2 病毒增殖
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩写词表10-11
• 前言11-12
• 第一篇 文献综述12-23
• 第1章 猪瘟病毒及检测方法研究进展12-18
• 1.1 猪瘟病毒基因组结构12-13
• 1.2 猪瘟病毒常规的检测方法13-17
• 1.3 构建猪瘟病毒报告细胞系的意义17-18
• 第2章 猪圆环病毒2型增殖方法的研究进展18-23
• 2.1 PCV基因组特征18
• 2.2 PCV2的增殖方法18-21
• 2.3 构建猪圆环病毒敏感细胞系的意义21-23
• 第二篇 研究内容23-64
• 第1章 猪瘟病毒感染报告细胞系的建立23-48
• 1.1 材料24-26
• 1.2 方法26-37
• 1.3 结果37-46
• 1.4 讨论46-47
• 1.5 小结47-48
• 第2章 PCV2敏感细胞系的建立48-64
• 2.1 材料48-50
• 2.2 方法50-57
• 2.3 结果57-62
• 2.4 讨论62-63
• 2.5 小结63-64
• 结论64-65
• 参考文献65-73
• 作者简介及攻读硕士期间发表的学术成果73-75
• 导师简介75-76
• 致谢76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘坤;兰邹然;姜平;;猪瘟病毒分子生物学及检测技术研究进展[J];动物医学进展;2012年10期

2 王雪玲;刘铁龙;;猪瘟病毒基因结构及诊断的研究进展[J];养殖技术顾问;2011年02期

3 王向鹏;张兴娟;孙元;李娜;贺番;常天明;李宏宇;杨增岐;仇华吉;;六种检测猪瘟病毒方法的比较[J];微生物学报;2010年08期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 杨鑫;PCV2体外培养特性的研究及HMGCR对PCV2复制的影响[D];吉林大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 徐燕;荧光素酶作为报告基因的丙型肝炎病毒细胞感染系统的建立和应用[D];复旦大学;2011年

2 张朝红;猪瘟四种实验室诊断方法的比较研究[D];西北农林科技大学;2007年

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本文编号：1123588