水貂CpG ODN的筛选及其对水貂伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用

发布时间：2017-11-02 06:31

  本文关键词：水貂CpG ODN的筛选及其对水貂伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用

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【摘要】：人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(synthetic oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)是备受人们关注的一种新型疫苗佐剂。它能够与多种免疫细胞内质网膜上的Toll样受体9(TLR-9)结合,引发机体产生固有免疫应答,通过促进Th1型免疫反应和分泌促炎因子来非特异性的增强适应性免疫应答的强度,在机体抵抗病原入侵和抗肿瘤等方面起到免疫增强剂的作用。CpG ODN作为疫苗佐剂具有高效、安全、可与其他佐剂联合使用的优点,但其免疫刺激活性复杂多变,具有种属特异性,这种特异性与其自身的碱基序列和分子结构密切相关。目前人们已相继发现了针对人、猪、牛、鸡、犬、猫等多种动物有效的CpG ODN,其作为免疫佐剂在人用疫苗领域的研究较为深入,但在兽用疫苗尤其是毛皮动物方面的研究开展的较为缓慢,国内外均未报道过对毛皮动物水貂具有免疫刺激活性的CpG ODN。本研究参考与水貂亲缘关系较近的犬的有效CpG基序,设计合成了25条不同的CpG ODN,通过体外刺激分离培养的水貂外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),从中筛选出能够有效刺激水貂PBMC增殖的CpG ODN,并对CpG ODN刺激水貂PBMC培养上清的抗病毒活性进行研究,获得了对水貂具有免疫刺激活性的CpG-23,并将其作为伪狂犬灭活疫苗佐剂在水貂体内进行了验证。首先通过对筛选条件的摸索,发现水貂外周血单个核细胞数为4×105个/孔,CpG ODN工作浓度为10μg/mL,37℃、5%CO2条件下刺激48 h时,以MTS比色法检测水貂PBMC增殖最明显。用此方法进行CpG ODN刺激水貂PBMC增殖能力检测,筛选出能够显著刺激水貂PBMC增殖的CpG-2、CpG-7、CpG-10、CpG-21、Cp G-23和CpG-24(p0.01),其中CpG-23、CpG-24的刺激指数(SI)分别高达14.874和14.261。进一步用CpG-23、CpG-24刺激水貂PBMC培养上清与伪狂犬病毒(PRV)共同作用于貂肺(ML)细胞,发现CpG-23刺激水貂PBMC培养上清能够一定程度的抑制PRV对ML细胞的感染,表现出一定的抗病毒活性。再分别用20μg、40μg和80μg的CpG-23与伪狂犬灭活疫苗联合免疫水貂,分析CpG-23对伪狂犬灭活疫苗免疫效果的影响。将25只2月龄健康水貂随机分成五组,分别为PBS组、疫苗对照组、20μg联合免疫组、40μg联合免疫组、80μg联合免疫组。首免后第14 d进行同剂量的二次免疫,在首次免疫后7、14、21和28 d分别采血,分离血清,检测血清中PRV中和抗体滴度。结果显示,不同剂量的CpG-23联合伪狂犬灭活疫苗免疫组的中和抗体效价均高于单独疫苗免疫组,且中和抗体水平随CpG-23使用剂量的增加而升高,表明CpG-23能够有效地辅助伪狂犬灭活疫苗在水貂体内产生更高水平的中和抗体。综上所述,本研究筛选出了能够在体外和体内均表现出对水貂具有良好免疫刺激活性的CpG-23,该新型CpG ODN有望作为一种新型疫苗佐剂应用于水貂疫苗,从而为CpG ODN在水貂疫苗中的应用奠定基础,提供实验依据。
【关键词】：CpG ODN 水貂 淋巴细胞增殖反应 伪狂犬灭活疫苗 中和抗体
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.92
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-11
• 第一篇 文献综述11-20
• 第一章 CpG ODN免疫佐剂效应研究进展11-17
• 1.1 CpG ODN的发现11-12
• 1.2 CpG ODN的种类及其结构、功能特征12-13
• 1.3 CpG ODN免疫佐剂效应的作用机制13-14
• 1.4 CpG ODN对不同畜禽的免疫增强作用14-15
• 1.5 CpG ODN作为疫苗佐剂使用的安全性15
• 1.6 展望15-17
• 第二章 水貂伪狂犬病17-20
• 2.1 病原学17
• 2.2 流行病学特点17-18
• 2.3 临床症状和病理变化18
• 2.4 诊断18
• 2.5 危害与防控18-20
• 第二篇 研究内容20-43
• 第一章 Cp G ODN刺激水貂PBMC增殖能力的检测20-32
• 1.1 材料和方法20-23
• 1.2 结果23-30
• 1.3 讨论30-31
• 1.4 小结31-32
• 第二章 CpG ODN刺激水貂PBMC培养上清抗病毒作用的研究32-36
• 2.1 材料和方法32-33
• 2.2 结果33-34
• 2.3 讨论34-35
• 2.4 小结35-36
• 第三章 CpG ODN对水貂伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用36-43
• 3.1 材料和方法36-38
• 3.2 结果38-41
• 3.3 讨论41-42
• 3.4 小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 作者简介48-49
• 致谢49

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本文编号：1130415