黑龙江省部分地区奶牛三种重要人兽共患原虫的分子鉴定及其遗传学特征

发布时间：2017-11-02 11:31

  本文关键词：黑龙江省部分地区奶牛三种重要人兽共患原虫的分子鉴定及其遗传学特征

  更多相关文章： 奶牛 肠道原虫 基因分型 多位点序列分型 人兽共患病

【摘要】：隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和芽囊原虫(Blastocystis spp.)是三种重要的人兽共患机会性肠道原虫,感染呈世界分布。其卵囊、孢子或者包囊在环境中广泛存在,由其引起的隐孢子虫病、微孢子虫病和芽囊原虫病严重危害着人和动物的健康,阻碍畜牧业的发展。黑龙江省是我国奶牛养殖重地,但有关这三种原虫在黑龙江奶牛中的感染率、虫种或基因型分布情况以及遗传学特征鲜有报道。本研究首先采用特异性巢式PCR结合测序的方法,对黑龙江省哈尔滨市、齐齐哈尔市和大庆市三个规模化奶牛养殖场的三种原虫的感染率、虫种/基因型和亚型进行确定。结果显示,隐孢子虫在黑龙江奶牛中的总感染率(24.7%,130/526;95%confidence interval(CI),0.205至0.290)显著高于芽囊原虫(10.3%,54/526;95%CI,0.075至0.130)和毕氏肠微孢子虫(5.9%,31/526;95%CI,0.038至0.080)(p0.01),为优势感染虫种。基于隐孢子虫(small subunit ribosomal RNA,SSU r RNA)基因的序列分析,在130个隐孢子虫PCR阳性样本中共鉴定出了5个虫种/基因型,分别是微小隐孢子虫(C.parvum,87/130)、牛隐孢子虫(C.bovis,28/130)、芮氏隐孢子虫(C.ryanae,5/130)、安氏隐孢子虫(C.andersoni,2/130)和似猪隐孢子虫基因型(C.suis-like genotype,2/130)。此外,还在哈尔滨一头断奶前犊牛中鉴定出微小隐孢子虫和牛隐孢子虫的混合感染(1/130)。微小隐孢子虫和牛隐孢子虫是黑龙江奶牛隐孢子虫优势虫种。微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫为人兽共患虫种。基于gp60(60 k Da glycoprotein gene)基因的DNA序列多态性,在87个微小隐孢子虫分离株中鉴定出了2个具有潜在致病力差异的IId亚型家族亚型,分别为IId A15G1(24/87)和IId A20G1(48/87)。这两个亚型曾在多个国家的人和动物中报道,因而具有重要的人兽共患重要性。其中,IId A20G1为首次在中国奶牛中发现,而IId A15G1为首次在黑龙江省报道。基于毕氏肠微孢子虫核糖体内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)的序列分析,在31个毕氏肠微孢子虫PCR阳性样本中鉴定出了11个基因型,包括6个已知的基因型(BEB4,CS-4,Ebp C,G,I,J)和5个新基因型(NECA1至NECA5)。在基于ITS位点的系统进化分析中,本研究鉴定的5个新基因型和已知基因型G、CS-4和Ebp C位于具有人兽共患可能性的进化组Group 1中;而基因型BEB4、I和J则分布于可能具有宿主特异性的进化组Group 2中。其中,已知基因型BEB4、CS-4、Ebp C、G、I和J均为人兽共患基因型。基于芽囊原虫SSU r RNA基因的序列分析,在54个芽囊原虫PCR阳性样本中鉴定出4个已知亚型,分别为ST4(2/54)、ST5(1/54)、ST10(41/54)、ST14(9/54)和一个新亚型ST18(1/54)。优势亚型为具有宿主特异性的ST10。其中,ST4和ST5为人兽共患亚型。本研究在中国首次报道奶牛芽囊原虫的感染率和亚型分布特征。本研究运用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)对部分微小隐孢子虫分离株和毕氏肠微孢子虫分离株进行亚型分型。共选取10个不同亚型(IId A15G1,n=5和IId A20G1,n=5)的C.parvum分离株在5个多态性位点(Actin,DZ-HRGP,HSP70,ML1和ML2)进行扩增,结果显示这些分离株只在DZ-HRGP、HSP70、ML1和ML2位点得到有效扩增,且核苷酸序列在各个位点上完全一致。因此,可初步断定微小隐孢子虫在黑龙江省哈尔滨市和齐齐哈尔市分别呈地方性流行。后期还需要在其它多态性位点,甚至基因组水平上对这两个亚型的群体进行群体遗传学研究,以确定其致病力的差异及群体结构特征。本研究还运用已经建立的MLST分型方法,对另外10个毕氏肠微孢子虫阳性DNA样本进行微卫星(MS1,MS3,MS7)和小卫星(MS4)遗传位点扩增。结果只有4个ITS基因型为CS4、BEB4和J的分离株在这些位点上得到有效扩增并显示出遗传多样性。系统进化分析显示,这些样本在不同遗传位点上均和经常在人中报道的亚型具有相近的遗传学关系。该研究结果暴露了ITS分型能力的不足,并验证了位于Group 2中的部分ITS基因型(BEB4和J)宿主范围已经扩大,并能感染人,因此同样具有人兽共患重要性。因此,在今后的研究中应使用具有高分辨率的MLST分型方法来评估新分离株的人兽共患可能性、追踪感染来源及阐明传播机制等科学问题。最后,用统计学方法对三种原虫中感染率较高的隐孢子虫进行了风险因素的分析。在单因素分析中,通过计算比值比OR(odds ratio)及其95%CI(confidence interval),发现饲养模式(室内密集圈养)、年龄(幼龄动物)、季节(春季和秋季)和养牛场的使用时间(10年)这4个因素均能增加奶牛患隐孢子虫病的风险。综上所述,本研究对黑龙江省奶牛三种重要的肠道原虫进行了感染率、虫种、基因型或亚型的分子鉴定并对其人兽共患可能性进行了评价,确定了齐齐哈尔奶牛场犊牛腹泻的病因并分析了引起隐孢子虫暴发流行的原因,明确了奶牛隐孢子虫病在该地区的传播动态和特征。本研究还运用MLST分型工具对部分隐孢子虫虫种和毕氏肠微孢子虫基因型在多个基因位点上进行了分子鉴定,获得了更为丰富的遗传学信息。另外,本研究首次对黑龙江省奶牛隐孢子虫病进行了风险因素评估,明确了科学的养殖模式和良好的卫生保健措施在控制隐孢子虫病人兽传播中的重要作用。
【关键词】：奶牛 肠道原虫 基因分型 多位点序列分型 人兽共患病
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-22
• 1.1 隐孢子虫基因分型和亚型分型13-15
• 1.2 隐孢子虫多位点序列分型和群体遗传学15-17
• 1.3 隐孢子虫比较基因组学17
• 1.4 毕氏肠微孢子虫的基因分型17-18
• 1.5 毕氏肠微孢子虫多位点序列分型和群体遗传学18-20
• 1.6 芽囊原虫基因分型20
• 1.7 研究目的与意义20-22
• 2 材料和方法22-28
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 临床粪便样本采集和流行病学资料收集22
• 2.1.2 主要试剂22-23
• 2.1.3 主要仪器设备23
• 2.2 方法23-28
• 2.2.1 DNA提取23
• 2.2.2 三种原虫虫种或基因型的鉴定23-24
• 2.2.3 微小隐孢子虫亚型分型和多位点序列分型24-25
• 2.2.4 毕氏肠微孢子虫多位点序列分型25-26
• 2.2.5 PCR产物测序26
• 2.2.6 测序结果分析26
• 2.2.7 统计学分析和风险因素分析26-27
• 2.2.8 系统进化分析27-28
• 3 结果28-43
• 3.1 不同群体奶牛三种肠道原虫的感染情况28-31
• 3.2 隐孢子虫的虫种鉴定31-32
• 3.3 微小隐孢子虫亚型鉴定及多位点序列分型结果32-33
• 3.4 毕氏肠微孢子虫基因型鉴定及系统进化分析结果33-35
• 3.5 毕氏肠微孢子虫多位点序列分型及系统进化分析结果35-40
• 3.6 芽囊原虫的基因型鉴定及系统进化分析40
• 3.7 影响隐孢子虫感染率的风险因素40-43
• 4 讨论43-50
• 4.1 黑龙江省奶牛隐孢子虫的感染情况和虫种分布43-44
• 4.2 微小隐孢子虫的亚型分布和多位点序列分型44-45
• 4.3 毕氏肠微孢子虫的感染情况、基因型分布及多位点序列分型45-47
• 4.4 芽囊原虫的感染情况和基因型分布47-48
• 4.5 隐孢子虫感染的风险因素48-50
• 5 结论50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-66
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文66

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