不同浓度α-促黑素细胞激素对绵羊黑素细胞增殖和黑素生成的研究

发布时间：2017-11-03 03:19

  本文关键词：不同浓度α-促黑素细胞激素对绵羊黑素细胞增殖和黑素生成的研究

  更多相关文章： 黑色素细胞 α-促黑素细胞激素(α-MSH) 黑素皮质素受体1(MC1R) cAMP路径 黑色索

【摘要】：α-MSH是一种重要的肽类激素,与MC1R结合通过cAMP信号通路影响黑色素的生成。本试验通过在体外培养的绵羊皮肤黑素细胞中添加不同浓度a-MSH,研究其对黑色素生成基因(MC1R、MITF、TYR)的表达、cAMP、cGMP含量和黑色素合成的影响,以揭示α-MSH在黑色素合成中的作用机制。本试验在传代培养的第七代绵羊皮肤黑素细胞培养基中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100、1000 nmol/L) α-MSH,培养72 h,主要实验结果如下：1与对照组相比,实验组细胞数量呈现明显的变化趋势,添加0.1-10 nmol/L使细胞数量呈上升趋势,100-1000 nmol/L使细胞数量下降,细胞呈现明显的树突状。2 qRT-PCR技术检测基因mRNA表达差异,结果表明：添加10 nmol/L时,基因表达水平最高,MC1R、MITF和TYR基因表达量分别是对照组的1.878倍(P0.05)、3.116倍(P0.01)、3.602倍(P0.01)。随着浓度的增高,基因的表达量呈下降趋势,但仍高于对照组。3 Western Blot检测蛋白表达差异,结果表明：MC1R、MITF、TYR和TYRP2蛋白表达量呈先升高后降低的趋势,添加10 nmol/L时,MC1R、MITF、TYR和TYRP2蛋白表达量最高,分别是对照组的1.687倍、1.514倍、1.386倍、1.265倍,均差异极显著(P0.01)。4 ELISA方法检测细胞内cAMP和cGMP含量的变化情况,结果显示：随着添加浓度的增高,cAMP的产量总体增加,cGMP的产量总体降低。添加10 nmol/L时,cAMP的产量增加最多,是对照组的1.372倍(P0.01), cGMP的产量降低最多,是对照组的0.464倍(P0.01)。5酶标法检测黑色素产量变化,结果发现：不同浓度α-MSH均促进黑色素合成。在10 nmol/L,黑色素合成增加最多,是对照组的2.551倍(P0.01),之后有所降低。由此得出结论：不同浓度α-MSH能促进绵羊皮肤黑素细胞数量增加、树突增长,黑色素生成增多,α-MSH通过调控黑色素形成的cAMP路径,影响MC1R、MITF和TYR基因的表达,从而影响黑色素的合成,但添加10 nmol/L α-MSH时,对黑色素细胞的表型及黑色素含量影响最为显著。
【关键词】：黑色素细胞 α-促黑素细胞激素(α-MSH) 黑素皮质素受体1(MC1R) cAMP路径 黑色索
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要8-9
• 前言9-10
• 文献综述10-19
• 1 黑色素细胞及其调节机制10-13
• 1.1 黑色素细胞的发育10
• 1.2 黑色素的生成10-12
• 1.3 黑色素生成相关的信号转导通路12-13
• 1.3.1 cAMP/PKA信号通路12
• 1.3.2 NO/cGMP/PKG信号通路12
• 1.3.3 DAG/PKC信号通路12-13
• 1.3.4 MAPK级联途径13
• 2 黑色素生成相关基因的研究13-16
• 2.1 黑素皮质素受体113-15
• 2.2 小眼畸形相关转录因子15
• 2.3 酪氨酸酶15-16
• 3 α-促黑素细胞激素与黑色素生成16-17
• 3.1 α-MSH的分子结构及来源16
• 3.2 α-MSH调控黑色素合成的机理16-17
• 3.3 α-MSH的研究进展17
• 4 研究目的和意义17-19
• 材料和方法19-33
• 1 绵羊黑色素细胞培养19-21
• 1.1 实验材料19-20
• 1.1.1 实验样本19
• 1.1.2 实验仪器19
• 1.1.3 主要试剂和耗材19
• 1.1.4 主要溶液的配制19-20
• 1.2 实验方法20-21
• 1.2.1 绵羊黑色素细胞复苏20
• 1.2.2 绵羊黑色素细胞传代20
• 1.2.3 绵羊黑色素细胞冻存20-21
• 2 细胞总RNA提取和qRT-PCR21-25
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 实验样本21
• 2.1.2 主要仪器21
• 2.1.3 主要试剂和耗材21-22
• 2.1.4 主要溶液的配制22
• 2.2 实验方法22-25
• 2.2.1 绵羊黑色素细胞总RNA的提取22-23
• 2.2.2 cDNA的合成23
• 2.2.3 引物设计23-24
• 2.2.4 荧光定量PCR反应体系及程序24-25
• 2.2.5 数据处理和统计分析25
• 3 Western Blot检测蛋白表达差异25-29
• 3.1 实验材料25-26
• 3.1.1 实验样本25
• 3.1.2 主要仪器25
• 3.1.3 主要试剂和耗材25-26
• 3.1.4 主要溶液的配制26
• 3.2 实验方法26-29
• 3.2.1 绵羊黑色素细胞总蛋白的提取26-27
• 3.2.2 考马斯亮蓝染色液检测总蛋白27-28
• 3.2.3 SDS-PAGE电泳28
• 3.2.4 转膜28
• 3.2.5 免疫反应28-29
• 3.2.6 化学发光29
• 3.2.7 凝胶图像分析29
• 4 黑色素细胞中cAMP和cGMP含量的测定29-31
• 4.1 实验材料29-30
• 4.1.1 实验样本29
• 4.1.2 主要仪器29
• 4.1.3 主要试剂和耗材29
• 4.1.4 主要溶液的配制29-30
• 4.2 实验方法30-31
• 4.2.1 ELISA试剂盒检测cAMP和cGMP含量30-31
• 5 黑色素的提取和含量的测定31-33
• 5.1 实验材料31
• 5.1.1 实验样本31
• 5.1.2 主要仪器31
• 5.1.3 主要试剂和耗材31
• 5.1.4 主要溶液的配制31
• 5.2 实验方法31-33
• 5.2.1 黑色素的提取和含量测定31-33
• 试验结果33-46
• 1 不同浓度α-MSH对绵羊皮肤黑色素细胞形态学影响33-34
• 2 不同浓度α-MSH对MC1R、MITF、TYR基因mRNA表达差异34-38
• 2.1 总RNA质量鉴定34
• 2.2 qRT-PCR实验结果34-36
• 2.3 不同浓度α-MSH对MC1R、MITF、TYR基因在转录水平的表达差异.36-38
• 3 不同浓度α-MSH对MC1R、MITF、TYR和TYRP2蛋白水平表达差异38-42
• 4 不同浓度α-MSH对黑色素细胞内cAMP和cGMP含量影响42-44
• 5 不同浓度α-MSH对黑色素细胞中黑色素含量的影响44-46
• 讨论46-50
• 1 不同浓度α-MSH对绵羊黑色素细胞增殖的影响46-47
• 2 不同浓度α-MSH对绵羊黑色素合成的影响47-50
• 2.1 不同浓度α-MSH对绵羊黑色素生成相关基因和蛋白影响47-48
• 2.2 不同浓度α-MSH对cAMP和cGMP影响48
• 2.3 不同浓度α-MSH对黑色素生成的影响48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-58
• Abstract58-60
• 致谢60

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1 马长俊,刘子s，

本文编号：1134418