绵羊肺炎支原体灭活疫苗的研制及免疫效果的评价

发布时间：2017-11-03 06:08

  本文关键词：绵羊肺炎支原体灭活疫苗的研制及免疫效果的评价

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【摘要】：绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)是感染绵羊或山羊的一种重要的致病性病原体,主要引起羊的间质性肺炎。1963年首次从患间质性肺炎的绵羊中分离得到该病原。国内于1979年首次从患肺炎的绵羊肺脏中分离得到,此后在国内逐步蔓延传播,造成了巨大的经济损失。为研发防控绵羊支原体肺炎的有效疫苗,在综合前期分析研究的基础上,本文对绵羊肺炎支原体灭活疫苗制备以及不同佐剂对绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫小鼠抗体水平比较、两种疫苗免疫羔羊免疫效果评价及攻毒保护试验等疫苗研发关键技术进行了试验研究,主要研究内容及结果如下:1.绵羊肺炎支原体灭活疫苗的研制及检测应用绵羊肺炎支原体新疆分离株MO-1411、MO-1421进行扩大培养,用膜分离设备对绵羊肺炎支原体培养物进行浓缩,甲醛灭活获得抗原,随后应用ISA 206双相佐剂试制了绵羊肺炎支原体灭活油佐剂疫苗,经无菌检测、物理性状检测、稳定性与保存期试验、动物安全性试验等检验,结果表明疫苗物理性状良好,置于4℃可保存180 d,接种试验动物后未见异常反应,注射部位未见化脓及红肿现象,表明疫苗安全可靠。本研究初步建立了MO灭活疫苗的制备工艺,为规模化生产提供了一定的方法与技术支持。2.两种进口佐剂对绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫小鼠抗体水平的比较应用ISA201与ISA206两种进口油佐剂分别制备绵羊肺炎支原体灭活疫苗,以不同剂量免疫健康成年小鼠,用MO正向间接血凝试剂盒测定第二次免疫后7、14、21、28d血清抗体效价,结果显示:ISA 206佐剂疫苗0.2 mL剂量组诱导机体产生的抗体时间最快抗体效价最高且维持时间长,均优于其它三个剂量组,ISA 206佐剂疫苗0.2 mL剂量组14d抗体效价达1:128,28d开始下降。说明ISA 206佐剂优于ISA201佐剂,可作为MO灭活疫苗的优选佐剂。3.绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫羔羊的免疫保护性评价为研发用于预防绵羊支原体肺炎灭活油佐剂疫苗并评价其免疫效。随机选取10-15日龄羔羊60只,分A、B、C三个免疫组,每组20只于10-15日龄首免,间隔14d进行二免,A组肌肉注射泰丰生物公司生产疫苗3 mL/只,B组肌肉注射本实验室所研究疫苗3 mL/只;C组肌肉注射本实验室研究疫苗2mL/只。测定三组羔羊免疫后14、21、28、35、42d血清抗体效价,并随机选取相同日龄免疫与未免疫羔羊各3只进行攻毒保护试验,每只羔羊经鼻腔黏膜接种(滴注)1 mL、气管注射2mL MO培养物(8.5×107 CFU/mL),记录羔羊体温、体重,观察临床症状,检测血清抗体水平。攻毒后28 d剖检观察肺脏临床解剖学及病理组织学变化,并采集病变肺脏组织进行MO分离培养。结果:A组免疫羔羊在免后28d血清MO抗体达到最高((5.8±1.31)log2),35d开始下降,3只攻毒羔羊均保持良好的精神状态且体温只是在攻毒前后波动较大,但在正常范围内,攻毒14d就能产生较高的抗体效价((4.33±0.57)log2),28d达到最高((6.33±1.52)log2),肺脏解剖学观察有轻微变化,病理组织学观察肺泡内有淤血、支气管周围炎性细胞浸润、肺间质增宽,肺脏中未分离回收到MO;B组免疫羔羊在免疫后21 d血清MO抗体达到最高((5.7±1.49)log2)维持到35d,C组免疫羔羊在免疫后28 d血清MO抗体达到最高((6.7±0.95)log2),35d下降两个梯度,3只攻毒羔羊均保持良好的精神状态且体温变化不明显,攻毒14d就能产生较高的抗体效价((4.33±0.57)log2),28d达到最高((6.66±0.57)log2),肺脏解剖学观察有轻微病变,病理组织学观察、支气管周围有淋巴细胞浸润、个别区域间质增生,肺脏中未分离回收到MO;3只未免疫对照组羔在攻毒后出现体温升高、轻度咳喘的症状,在21d抗体效价才达到((4.33±0.57)log2),28d达最高((5.33±0.57)log2),羔羊肺脏出现米粒大小及黄豆大小的白色结节,肺门淋巴结肿大,个别区域出现肝变,与自然感染的病例相似,病理组织学观察可见支气管周围淋巴细胞浸润、肺间质增宽、支气管内有淤血,支气管上皮细胞脱落等病理变化,从两只羔羊病变肺组织中分离回收到MO。结果表明:本研究制备的绵羊肺炎支原体灭活疫苗与泰丰生物技术有限公司所产绵羊支原体肺炎疫苗免疫羔羊后使机体产生的抗体水平差异不显著,可用于绵羊支原体肺炎的预防,两种疫苗都能起到诱导机体产生良好的免疫应答反应,并能抵抗MO感染所致的肺脏病变作用。
【关键词】：绵羊肺炎支原体 抗原浓缩 灭活疫苗 免疫抗体 免疫保护
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.26
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 符号说明12-13
• 引言13-14
• 第一章 文献综述 绵羊肺炎支原体、绵羊支原体肺炎疾病及绵羊肺炎支原体疫苗研究进展14-26
• 1.绵羊肺炎支原体概述14-25
• 1.1 绵羊肺炎支原体病原学14-17
• 1.2 绵羊肺炎支原体流行病学17-18
• 1.3 绵羊支原体肺炎临床症状及病理变化18-19
• 1.4 绵羊肺炎支原体致病机理19-20
• 1.5 绵羊肺炎支原体的检测技术20-22
• 1.6 绵羊肺炎支原体病的治疗及防制技术22-23
• 1.7 绵羊肺炎支原体诱导的免疫反应23
• 1.8 绵羊肺炎支原体疫苗研究进展23-25
• 2.结语25-26
• 第二章 试验研究26-50
• 试验一 绵羊肺炎支原体灭活疫苗的研制及检测26-33
• 1 材料27
• 1.1 菌株、培养基及相关试剂材料27
• 1.2 主要仪器设备27
• 2. 方法27-29
• 2.1 抗原的制备27
• 2.2 超滤浓缩法27-28
• 2.3 绵羊肺炎支原体抗原菌悬液灭活28
• 2.4 绵羊肺炎支原体支原体灭活疫苗的制备及检测28-29
• 3 结果29-30
• 3.1 浓缩方法蛋白含量以及CFU计数结果29
• 3.2 膜分离设备消毒试验结果29
• 3.3 菌悬液灭活检验29
• 3.4 疫苗无菌检验29
• 3.5 动物安全性试验结果29-30
• 3.6 物理性状检测结果30
• 3.7 稳定性及保存期试验结果30
• 4 讨论30-32
• 试验一结论32-33
• 试验二 两种进口佐剂对绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫小鼠抗体水平的比较33-39
• 1.材料与方法34
• 1.1 试验菌株34
• 1.2 培养基34
• 1.3 试验动物34
• 1.4 佐剂及试剂盒34
• 1.5 主要仪器设备34
• 2 方法34-36
• 2.1 抗原制备34
• 2.2 绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备34-35
• 2.3 免疫方法及血样的采集35
• 2.4 抗体水平检测方法35-36
• 3 结果36-37
• 3.1 抗体水平检测36-37
• 4 讨论37-38
• 试验二结论38-39
• 试验三 绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备及羔羊免疫保护的初步评价39-50
• 1 材料和方法40-41
• 1.1 试验菌株、培养基及实验动物40
• 1.2 主要试剂及仪器设备40
• 1.3 菌液扩大培养及浓缩40
• 1.4 绵羊肺炎支灭活疫苗的制备及检测40-41
• 1.5 疫苗免疫程序及抗体检测41
• 1.6 攻毒保护试验与评价指标41
• 2 结果与分析41-46
• 2.1 免疫羔羊后抗体水平变化41-42
• 2.2 免疫后羊体重变化42-43
• 2.3 试验羔羊攻毒后抗体水平变化43
• 2.4 试验羔羊攻毒后体重变化43-44
• 2.5 攻毒后羊体温变化曲线44
• 2.6 试验羔羊攻毒后临床症状44
• 2.7 攻毒羔羊肺脏病理解剖学变化44
• 2.8 攻毒羔羊肺脏病理组织学变化44-46
• 2.9 攻毒羔羊肺组织中MO分离结果46
• 3 讨论46-49
• 试验三结论49-50
• 全文结论及创新点50-51
• 参考文献51-55
• 致谢55-56
• 作者简介56-57
• 导师评阅表57

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