表达鸡柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白的乳酸乳球菌免疫保护作用

发布时间：2017-11-04 10:07

  本文关键词：表达鸡柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白的乳酸乳球菌免疫保护作用

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【摘要】：鸡球虫病是由寄生于鸡肠道的艾美耳球虫引起的一种严重影响养禽业发展的原虫病。鸡球虫病给养禽业带来庞大的经济损失。现阶段,鸡球虫病的防治主要依靠化学药物,由于抗药性、药物残留以及新药物开发费用巨大等一系列问题,因此探索出安全、稳定、有效的替代方法来防治鸡的球虫病已势在必行。球虫子孢子主要是通过自身分泌蛋白进行识别和黏附,进而入侵鸡的肠道黏膜细胞。乳酸乳球菌可以作为疫苗的递送载体,其表达的目的蛋白和子孢子入侵前分泌的表面蛋白相似,也同样可激发有效保护性免疫应答。选择乳酸乳球菌作为黏膜免疫方面的活载体疫苗已成为目前研究的热点之一。顶复门寄生原虫的顶膜抗原(AMA1)在虫体入侵宿主细胞过程中具有重要作用,但关于鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)子孢子顶膜抗原(Et AMA1)的功能报道较少。本研究探索了表达Et AMA1的重组乳酸乳球菌抗球虫感染的免疫保护作用。研究首先将Et AMA1胞外域基因片段(Ecto AMA1)克隆入原核表达载体p ET-30a(+)中构建重组质粒p ET30(a)-EctoAMA1。将鉴定正确的质粒转入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用SDS-PAGE和Western blot方法检测目的蛋白表达。使用表达的蛋白对新西兰白兔进行免疫以制备多克隆抗体。应用间接ELISA方法检测制备的抗体效价,并采用Western blot方法检测多抗的反应性。结果表明,Ecto AMA1基因全长为1269bp,SDS-PAGE和Western blot分析显示,Ecto AMA1在大肠杆菌中以不溶性包涵体的形式进行表达,其表达的重组蛋白的分了量约为52 k Da。多克隆抗体检测效价达到218,Western blot结果显示制备的兔抗AMA1多抗能与子孢子反应。之后将Ecto AMA1基因克隆入乳酸菌表达载体p TX8048中,构建三种重组阳性质粒,即p TX8048-Ecto AMA1、p TX8048-SP-Ecto AMA1和p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA。将鉴定正确的阳性质粒电转化入宿主菌L.lactis NZ9000中筛选到可胞内、分泌和表面表达目的蛋白三种阳性菌L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA。使用终浓度为5 ng/mL的Nisin诱导重组菌后,Western blot方法检测到Ecto AMA1蛋白可以三种方式在宿主菌内表达。将诱导后5 109 CFU L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA分别于4~6、17~19、31~33日龄三次口服免疫SPF雏鸡。43日龄除PBS组外其他各组分别采取口服方式接种4×104个E.tenella孢子化卵囊。检测各组雏鸡外周血和脾脏中淋巴细胞的增殖功能变化、外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量变化,血清抗体Ig G变化、增重变化、盲肠病变计分、OPG及ACI等评价指标。结果显示,L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA组免疫保护效果最好,L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1组稍优于L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1组,三个免疫组各项指标均优于相应对照组;各免疫组淋巴细胞增殖活性均显著高于对照组;流式细胞仪检测结果显示,各免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚型数量均高于对照组;ELISA方法检测血清Ig G结果显示,三种重组菌免疫组抗AMA1血清抗体效价三次免疫后持续升高,42日龄时达到最高值,对照组未见升高;L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA组、L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1组和L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1组综合抗球虫指数值分别为162.50、155.19和152.45。实验结果提示,以乳酸乳球菌为活疫苗载体经口服免疫后可以刺激宿主产生有效的免疫应答,对抗同源感染可起到一定的保护作用。研究将为基于Et AMA1的鸡球虫病乳酸菌口服疫苗研制提供重要参考。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
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本文编号：1138943