鸡传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-11-04 17:31

本文关键词：鸡传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【摘要】：传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV)引起鸡的一种呼吸道疾病,具有高度的传染性,在世界各地均有流行。该病可引起病鸡呼吸困难、咳出血样分泌物,产蛋率下降甚至死亡。研制简便、快速、准确的诊断方法对ILT的防治至关重要。本研究制备了抗ILTV gB、gD蛋白的单克隆抗体,建立了ILTV双抗体夹心ELISA抗原检测方法,为ILT的快速检测和诊断提供了一种有效的手段。首先利用原核表达的IL TV gB、gD蛋白为抗原分别免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,取血清抗体效价大于104的免疫小鼠脾脏制备的脾细胞与SP2/0细胞融合；利用间接ELISA方法进行杂交瘤细胞的筛选及亚克隆,最终获得能稳定分泌抗ILTV gB和gD蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株各2株,分别命名为5A8、1C1、4D6和7D9。制备腹水后,用protein G层析柱纯化腹水；利用间接ELISA方法对纯化后的腹水进行抗体效价测定,4株杂交瘤细胞诱生的腹水效价都大于1：105；Western Blot试验结果表明,4株单抗都能与其相应的蛋白特异性识别；间接免疫荧光试验检测结果表明,4株单抗均可与感染ILTV的LMH细胞产生特异性荧光反应。然后,进一步利用交叉配对法对单抗及酶标单抗进行试验,最终确定以ILTV单克隆抗体7D9作为包被抗体,以酶标抗体7D9-HRP作为检测抗体,建立了ILTV双抗体夹心ELISA抗原检测方法。试验反应条件优化为：单克隆抗体包被浓度为5μg/mL, 4℃包被过夜;用1%BSA封闭液封闭,37℃孵育120 min；待检抗原37℃孵育60 mmin;酶标抗体工作浓度为2.5μg/mL,37℃孵育60 min。该方法与禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)均无交叉反应,检测ILTV最低病毒量为102TCID50/mL,该方法在批次内、批间内的变异系数均小于8%。用建立的双抗体夹心ELISA检测方法与PCR方法同时对40份临床样品进行检测,结果显示该方法与PCR的符合率为89.2%,说明本研究双抗体夹心ELISA抗原检测方法的特异性、敏感性及重复性均较好,为ILT的流行病学调查及诊断提供了帮助。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31

【参考文献】

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