shRNA抑制猪传染性胃肠炎病毒在PK-15细胞中增殖的研究

发布时间：2017-11-06 06:27

  本文关键词：shRNA抑制猪传染性胃肠炎病毒在PK-15细胞中增殖的研究

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【摘要】：猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病,以脱水、腹泻和呕吐为临床症状。任何年龄和品种的猪都可感染,尤其是2周龄以内仔猪,给世界各地养猪业造成了巨大损失。常规药物针对TGE没有明显的治疗效果,虽然通过疫苗接种和屠宰感染猪在一定程度上能控制TGE的流行,但免疫失败时有发生。因此有必要探索新的抗病毒方法来对该病进行防控。RNA干扰是一种由双链小RNA介导的以序列特异性方式诱导同源m RNA降解的基因沉默机制。由于RNAi技术能够特异性阻断特定基因的表达,所以该技术被认为是抗病毒感染的最有效方法之一。TGEV属冠状病毒科冠状病毒属、基因组为不分节段的单股正链RNA,长约2.86×104bp,主要包括4种结构蛋白。M基因在TGEV形态发生过程中具有关键作用,本文根据TGEV M基因的结构序列和短发卡RNA(shRNA)序列设计原则,设计并合成了3对shRNA序列,构建成RNA干扰载体。将重组质粒在转染剂的介导下导入猪肾细胞(PK-15),接种TGEV后,分别从病毒感染滴度、基因表达产物和病毒基因组RNA复制水平三个方面研究特异性shRNA对TGEV在PK-15中增殖的影响。主要结果如下:1.从TGEV CQ毒株中扩增M基因并获得核苷酸序列,生物信息学分析结果表明不同分离株的M基因高度保守,与南京SHXB株亲缘关系最近,属于同一分支,M蛋白存在信号肽,剪切位点在16-17位氨基酸之间,存在3个跨膜区,是以β-折叠和β-转角为主的蛋白。2.分别设计了靶向TGEV CQ株M基因103~121位、358~376位和625~643位m RNA的编码shRNA的单链核苷酸,经退火后形成编码shRNA的双链DNA,将其分别与表达载体pRNAT-U6.1/Neo连接,成功获得重组干扰质粒载体pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3。PK-15细胞培养到50-70%融合时,对细胞分别转染不同的干扰质粒载体,转染24h后进行荧光观察确认表达载体成功转入细胞。3.PK-15细胞转染干扰质粒载体后培养24h,接种1×103 TCID50 TGEV继续培养48h后,通过CPE、TCID50、IFA和Real time RT-PCR分析TGEV在PK-15细胞中的增殖情况。CPE分析发现,对照孔在接种TGEV 48h后,大部分细胞出现典型的细胞病变,pRNAT-1细胞的病变程度也较重,相比之下,干扰质粒pRNAT-2和pRNAT-3能减轻TGEV在PK-15细胞上引起的特异性病变。IFA和TCID50结果进一步表明,pRNAT-2和pRNAT-3干扰质粒能在蛋白水平上有效抑制病毒的增殖。此外,Real time RT-PCR结果显示3个干扰质粒pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3在m RNA水平上抑制效率分别为13%,68%和70%,表明3个干扰质粒在不同程度上能抑制病毒基因组的复制,其中完全靶向M基因保守结构域的pRNAT-2和pRNAT-3干扰质粒抑制效果好于干扰质粒pRNAT-1。总之,通过RNAi途径在细胞水平上研究TGEV M基因功能和复制的关系,发现靶向TGEV M基因358~376位和625~643位的si RNA能在m RNA和蛋白水平有效抑制TGEV的复制,保护PK-15细胞抵御TGEV CQ株引起的细胞病变。这能为后期筛选特定分子抑制剂提供靶标位点以及为新型药物的研制提供理论依据。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1147744