PRRSV的分离鉴定和VLPs的构建

发布时间：2017-11-06 08:42

  本文关键词：PRRSV的分离鉴定和VLPs的构建

  更多相关文章： 猪繁殖与呼吸综合征 GP5 M 病毒样颗粒

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种接触性传染病,主要引起母猪流产及仔猪呼吸系统障碍,其高发病率和致死率给养猪业造成重大的经济损失。目前防控PRRS的措施除了严格的生物安全措施外,最有效的办法就是疫苗接种。临床上主要采用灭活疫苗和弱毒疫苗预防免疫,但其存在免疫效果差和返毒等缺陷,使得人们的目光不得不转向其他新型疫苗的研制以控制PRRS的发生和流行。本研究通过对PRRSV重庆株的分离鉴定,选取其GP5和M基因,构建PRRS病毒样颗粒(Virus-like Particles,VLPs),在小鼠体内进行免疫活性的评估,为研制PRRS的新型疫苗奠定基础。1重庆株PRRSV的分离鉴定从重庆某猪场采集病死猪病料,经RT-PCR初步鉴定其病原为PRRSV后,利用反转录合成c DNA,设计NSP2和GP5基因片段的特异性引物,并对其扩增,序列测序,分析鉴定。结果表明,该分离株的NSP2基因与经典毒株VR-2332核苷酸同源性仅为66.7%,与高致病变异株SD、JXA1的核苷酸同源性高达98.8%,GP5基因在个别碱基上也存在变异,由此表明该毒株为高致病性(High Pathogenicity,HP)PRRSV变异株。同时将该病料接种于Marc-145细胞,可观察到典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE),经Reed-Muench计算该分离株的病毒滴度为10-5.67 TCID50/0.1 m L。2 PRRSV-VLPs的构建为构建HP-PRRSV病毒样颗粒(VLPs)疫苗,本研究以分离鉴定的HP-RRSV重庆株(CQ)的GP5和M全部编码基因为模板,利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统,共表达GP5和M蛋白,并采用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行定性分析;蔗糖梯度离心进行纯化;通过电子透射显微镜对VLPs进行直观的形态学鉴定。结果表明:利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统能够成功的共表达GP5和M蛋白,并能自动装配成VLPs,并显示具有与天然蛋白类似的免疫原性;电镜观察到VLPs的形态与文献中描述一致,直径约50 nm。3 PRRSV-VLPs免疫活性测定BALB/c小鼠肌肉三次注射不同剂量(5.0,10.0,20.0,50.0,100.0μg)的PRRSV-VLPs疫苗,用商用的灭活疫苗做阳性对照,无菌的生理盐水做阴性对照。结果显示阳性对照组和实验组GP5抗体滴度显著高于阴性对照;在免疫剂量50.0、100.0μg PRRSV-VLPs的小鼠血清中检测到中和抗体;实验组和阳性对照组都检测到细胞因子水平,其中,免疫20.0μg PRRSV-VLPs小鼠的IL-4水平显著高于其他组;免疫50.0μg PRRSV-VLPs小鼠的IFN-γ水平显著高于其他组;整体规律不明显。这些数据表明PRRSV-VLPs能够诱导小鼠产生较高水平的细胞免疫和体液免疫,是预防PRRS的一种潜在候选疫苗。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1148197