表达yenI基因的APEC重组菌的致病机理研究

发布时间：2017-11-12 10:16

  本文关键词：表达yenI基因的APEC重组菌的致病机理研究

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【摘要】：由禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli, APEC)引起的禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是家禽局部或全身性感染的急性或慢性传染性细菌疾病的总称,造成家禽的呼吸道感染和败血症,给养禽业造成了严重的经济损失,成为最严重的细菌性传染病之一。随着集约化养禽业的发展,目前在全国大部分省市都报道过此类疾病的爆发。大肠杆菌致病机理和防控研究一直是学术界研究的重要领域和热点课题；大肠杆菌致病性与其自身毒力因子密切直接相关,而这些毒力因子必需共同作用于宿主机体,发挥毒力致病作用,造成机体损害。细菌毒力因子受到严格调控,群体感应系统则参与了这一重要调控过程。本试验研究探析了大肠杆菌群体感应I型系统的相关调控功能,为病原体和机体相互作用的深入研究和大肠杆菌感染的防控提供新颖的理论基础。在细菌生长过程中,能够释放特定信号分子；通过对这些信号分子的感知,细菌可以确定周边环境中的同类数量,并据此调节特定信号分子相关的多种毒力基因；这种现象被称作群体感应(Quorum Sensing),而参与群体感应系统的特定信号分子被称为自体诱导子(Autoinducer, AI)。I型群体感应系统由信号分子合成蛋白和信号分子受体构成,即Luxl和LuxR。事实上,禽源致病性大肠杆菌仅有接受信号分子的SdiA受体蛋白,缺乏Luxl同源蛋白,自身不能合成AHL(N-酰基高丝氨酸内酯)信号分子,只能通过感受环境中其他菌群合成的AHL调控自身毒力。鉴于APEC毒力因子的复杂性,且APEC中I型群体感应系统对细菌毒力调控机制一直未得到阐明。为更好的理解I型群体感应系统功能及APEC发挥毒力作用途径,本研究选择禽源致病性大肠杆菌分离株CE129作为研究对象,将小肠结肠炎耶尔森菌yenl基因克隆入CE129中,赋予其内源合成C6-HSL信号分子的能力,并通过生物报告菌pSB401加以确证。随后利用λ-Red同源重组系统对APEC CE129菌sdiA基因进行敲除,使其缺失感应环境中AHL信号的能力。生长曲线实验表明野生株CE129、重组株CE129/pyenⅠ和缺失株CE129△sdiA与阴性对照株CE129/pBR生长无显著差异；通过体外竞争性试验证明I型QS系统作用下重组株CE129/pyenⅠ与缺失株CE129△sdiA相比并未获得生长优势；通过生物被膜实验,发现CE129在AHL信号作用下生物被膜形成能力显著降低,且进一步通过外源添加梯度浓度C6-HSL信号,确定CE129受AHL信号影响的阈值浓度为84μg/mL;耐药性试验中,AHL影响下CE129对四环素、氯霉素、氧氟沙星和诺氟沙星的抗性没有明显变化；鸡血清杀菌实验,AHL同样未显示出明显调控功能。泳动性试验和鞭毛fliC基因的荧光定量试验结果显示,鞭毛基因fliC并不受AHL信号分子影响,这一现象与EHEC、ETEC等其他血清型大肠杆菌迥异;重组菌CE129/pyenⅠ耐酸性基因gadA的表达比野生株下降37.1%,而耐酸性实验并未显示明显差异,这一结果与猪源、人源致病性大肠杆菌有较大差异。鸡巨噬细胞系HD11细胞吞噬试验和鸡成纤维细胞系DF1细胞黏附试验显示,AHL影响下重组菌巨噬细胞胞内生存能力及黏附能力显著强于野生株,而细菌主要黏附素鞭毛表达无明显变化,Ⅰ型菌毛表达量下降,其对HD11细胞和DF1细胞黏附增强机制尚不明晰。Ⅰ型与Ⅱ型群体感应系统的协同调控关系也受到进一步探索。Ⅱ型QS系统重要基因中,lsrR(QS-Ⅱ受体调控基因)表达量下降46.4%。综上所述,在Ⅰ型群体感应系统影响下,禽源性大肠杆菌CE129的生物被膜形成、抗吞噬能力和粘附能力受到严密调控；进一步确证Ⅰ型QS激活Ⅱ型QS; APEC耐酸性、鞭毛泳动性受AHL调控等现象与ETEC、EHEC存在较大差异。上述结果为进一步探索群体感应系统调控APEC致病机制奠定基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

【参考文献】

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1 朱丛睿;周明旭;陶洁;朱国强;;不同动物源大肠杆菌gapA看家基因的克隆及序列比较[J];中国家禽;2013年17期

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本文编号：1175488