多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白的表达及免疫原性研究

发布时间：2017-11-13 01:16

  本文关键词：多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白的表达及免疫原性研究

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【摘要】：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是能引起牛、猪、家禽、兔等多种动物传染病的病原体,临床上多以出血性败血症和呼吸系统疾病的形式出现,影响动物的健康生长,给养殖业造成了巨大的损失。现在防治巴氏杆菌病的主要措施是注射疫苗和使用药物,现有的疫苗主要有灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗。铁是微生物代谢过程中电子转移链的必需元素。动物体内含有多种含铁蛋白,如血液中的转铁蛋白、分泌物中的乳铁蛋白以及细胞内的铁蛋白,包括多杀性巴氏杆菌在内的绝大多数细菌物种形成了一些从宿主摄取含铁蛋白的机制,即利用细菌编码的多个外膜蛋白进行含铁蛋白的摄取。其中细菌的转铁结合蛋白(Transferrin binding protein,Tbp)能够调节细菌从宿主摄取转铁蛋白,通常包含Tbp A和Tbp B两个蛋白。本实验室分离的多杀性巴氏杆菌HB01株,经全基因组测序证明仅有Tbp A蛋白,缺乏Tbp B蛋白,Tbp A蛋白构成Pm的外膜蛋白。本研究将多杀性巴氏杆菌HB01株的tbp A基因片段克隆表达,将表达产物免疫小鼠后验证其在小鼠水平上的保护力。并将其与副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)和传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的Tbp A蛋白进行了交叉免疫保护力的测定,为研制预防巴氏杆菌科疾病的亚单位疫苗奠定基础。具体研究内容如下:1.Pm-Tbp A、HPS-Tbp A、APP-Tbp A蛋白的克隆表达参照本实验组测序的HB01多杀性巴氏杆菌基因组设计Pm-tbp A的上下游引物,根据副猪嗜血杆菌SH0165基因组、传染性胸膜肺炎放线杆菌JL01的基因组分别设计HPS-tbp A、APP-tbp A基因的引物,以HB01、SH0165、APP4074细菌基因组为模板PCR分别扩增tbp A基因,重组构建p ET-Pm-tbp A、p ET-HPS-tbp A、p ET-APP-tbp A原核表达载体,并转化到BL21中进行表达,在37℃条件下,终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导3h,SDS-PAGE验证蛋白成功获得表达。大量表达、纯化三种蛋白,最终得到Pm-Tbp A蛋白浓度为1.2mg/m L,HPS-Tbp A蛋白浓度0.8mg/m L,APP-Tbp A蛋白浓度为0.75mg/m L。2.Pm-Tbp A蛋白对小鼠免疫原性评价用100μg/200μL Pm-Tbp A蛋白免疫小鼠,另设200μL PBS免疫对照组。二免后14d,用5LD50的HB01攻毒,15h后测定肺脏和血液的载菌量,结果显示免疫组肺脏、血液含菌量分别为107 CFU/g、2×107CFU/ml,对照组肺脏、血液含菌量分别为2×108CFU/g、108CFU/ml,免疫组与对照组相比小鼠组织(肺脏、血液)载菌量分别下降了20倍和5倍。另按此免疫方案进行Pm-Tbp A蛋白的免疫保护力测定,结果显示,该蛋白针对小鼠免疫保护力为70%,表明Pm-Tbp A蛋白具有一定的免疫原性。3.三种细菌的Tbp A蛋白免疫小鼠后的交叉免疫保护力试验将Pm-Tbp A、HPS-Tbp A、APP-Tbp A蛋白分别免疫三组小鼠依次为A/B/C、D/E/F、G/H/I组,J/K/L三组为PBS空白对照组。二免后14d,A、D、G、J组用5LD50的HB01攻毒,B、E、H、K组用5LD50的SH0165攻毒,C、F、I、L组用5LD50的APP4074攻毒,观察72h,记录临床症状和死亡数目。取病变部位进行病理学观察分析,动物实验过程中分别在一免后0、14、28d尾静脉采血,检测抗体水平。结果表明:三个不同细菌来源的Tbp A蛋白对各自宿主菌的保护率均为67%,HPS-Tbp A、APP-Tbp A蛋白免疫组相互间交叉保护率均为50%,对HB01的保护力为16.7%和33%,Pm-Tbp A提供给HPS和APP的保护力为16.7%。肺部组织外观观察显示,免疫组存活的小鼠肺部轻微水肿、出血现象较轻,而对照组出现了严重的出血水肿现象;病理切片观察对照组肺泡间隔破裂出血严重,免疫组肺泡损伤较小,仅有轻微的充血现象。这些结果证明三种蛋白具有不同水平的交叉免疫保护力。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

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本文编号：1178448