外泌小体介导猪瘟病毒在ST细胞之间扩散的机制研究

发布时间：2017-11-17 01:19

  本文关键词：外泌小体介导猪瘟病毒在ST细胞之间扩散的机制研究

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【摘要】：猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的严重危害全球养猪业的猪烈性传染病。CSFV如何劫持宿主细胞的生物合成系统来进行病毒粒子的释放和扩散尚不清楚。大量研究证实,携带病毒基因组或病毒粒子的外泌小体(exosome)能够介导病毒在细胞之间的传递从而引起病毒感染。目前,外泌小体是否也能够携带猪瘟病毒基因组RNA或病毒粒子从而介导病毒在细胞之间的扩散尚未报道。为了研究外泌小体在猪瘟病毒扩散和感染中的作用,本研究利用Total exosome isolation kit结合碘克沙醇密度梯度离心对猪瘟病毒GD53株感染猪睾丸细胞(swine testicle,ST)培养上清中的外泌小体(GD53-外泌小体)进行提纯。提取的GD53-外泌小体进行电镜观察、Western blot、Real-time PCR及病毒滴度测定以鉴定外泌小体是否介导CSFV在细胞之间的感染和扩散。同时构建仅含猪瘟非结构蛋白的亚基因组复制子(GD53-SGR)及其细胞系,将亚基因组复制子细胞系产生的外泌小体(SGR-外泌小体)与正常ST细胞孵育,明确外泌小体是否介导GD53-SGR在ST细胞之间的扩散。电镜观察发现,提取的外泌小体直径为30-80 nm。Western blot结果显示,从GD53感染细胞培养上清中提取的GD53-外泌小体含有标志蛋白TSG101和Alix,但不含有病毒蛋白Core和Npro蛋白。进一步分析发现,外泌小体和感染性粒子主要存在于12-21%碘克沙醇密度层中,其中15%和18%密度层中外泌小体标志蛋白TSG101以及感染性粒子的数目最多,表明感染性粒子的滴度与外泌小体的量成正相关。纯化的外泌小体样品病毒全长基因组RT-PCR扩增和病毒滴度测定发现外泌小体含有病毒基因组RNA且具有感染性,这些结果初步表明外泌小体能介导猪瘟病毒在细胞之间的扩散。有意思的是,从GD53-SGR细胞系提取的SGR-外泌小体能进入正常的ST细胞,表明外泌小体可以携带CSFV GD53-SGR在细胞之间进行传递。综上所述,本研究成功分离和纯化了猪瘟病毒感染ST细胞产生的外泌小体,这些病毒修饰的外泌小体不含病毒结构蛋白Core,但能携带病毒基因组RNA或亚基因组复制子RNA从而获得感染细胞的能力,可以介导猪瘟病毒在细胞之间进行扩散。因此,本研究更新了我们对猪瘟病毒粒子存在形式的传统认识,为进一步阐明外泌小体介导猪瘟病毒扩散与感染的分子机制奠定基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651

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本文编号：1194340