鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因缺失株的构建及免疫效力评价

发布时间：2017-11-21 16:09

  本文关键词：鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因缺失株的构建及免疫效力评价

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【摘要】：鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起,各种日龄鸡均可感染的一种急性或慢性传染病,该病既可水平传播又可垂直传播,对家禽养殖业的发展存在巨大威胁。国家动物疫病长期控制规划中对种鸡群提出净化要求,如何有效减少沙门菌的带菌率是目前亟待解决的问题。疫苗免疫可有效地降低鸡群的带菌率,对种群的净化具有积极作用。因此,研制安全、有效的基因缺失疫苗用于区别自然感染与疫苗免疫显得尤为重要。关于沙门菌等革兰氏阴性菌的研究表明,脂多糖不仅是合成外膜的重要组成部分,也是细菌发挥毒力的重要因子。随着人们对沙门菌的致病机理、毒力基因、脂多糖及疫苗应用研究的不断深入,通过基因工程方法制备减毒活疫苗已取得重大成就,并显示出良好的应用前景。本研究利用同源重组技术成功构建鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因的缺失株,并对其相关生物学特性进行评价；其次,通过评价各沙门菌缺失株的毒力和免疫效力,为鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株的筛选奠定基础。1.鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因缺失株的构建根据鸡白痢沙门菌S6702株的LPS合成相关基因rfbA、rfbL、rfbJ、rfbI、rfbG、rfbF设计引物,PCR扩增后利用λ-Red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌缺失株S6702△rfbA、 S6702△rfbL、S6702△rfbJ、S6702△rfbI、S6702△rfbFG和S6702△rfbF。通过PCR扩增及序列测定证实缺失株构建成功。生长曲线测定显示,缺失株与野生株的生长速率无显著性差异。生物被膜形成能力测定显示,与野生株相比,S6702△rfbJ和S6702△rfbF的生物膜形成能力无显著性差异,S6702△rfbA和S6702△rfbI的生物膜形成能力显著增强,而S6702△rfbL和S6702△rfbG的生物膜形成能力显著减弱。提取脂多糖进行SDS-PAGE,结果表明6株缺失株LPS的分子量相应变小,显示LPS的糖链合成受阻,进一步证实缺失突变株构建成功。2.鸡白痢沙门菌基因缺失株的致病性和免疫原性评价通过肌肉接种2日龄SPF雏鸡,测定其半数致死量(LD50),结果显示野生株S6702的LD50为3.2×108CFU,缺失株S6702△rfbA、S6702△rfaL、S6702△rfaJ, S6702△rfaI、 S6702△rfaG和S6702△rfaF的LD50分别为1.5×109CFU、1.5×109CFU、1.4×109 CFU、2.2×109CFU、1.0×109CFU、2.5×109CFU, LD50结果说明缺失株的致病力较野生株均下降。免疫原性评价试验中,2日龄SPF雏鸡免疫后S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG免疫组的体重与健康对照组相比无显著差异,S6702△rfaJ, S6702△rfaI和S6702△rfaF免疫组的体重明显下降。玻板凝集试验证实野生株血清与S6702抗原产生凝集反应,缺失株免疫血清与S6702抗原不产生凝集反应。利用间接ELISA检测血清中IgG抗体,免疫10天后IgG抗体水平较低。免疫保护试验结果表明,对2日龄SPF雏鸡免疫后l0天进行野生株S004攻毒,缺失株均能提供完全保护。将缺失株免疫30日龄SPF鸡,利用间接ELISA法检测血清中抗体,结果表明加强免疫后所有缺失株均可诱导产生IgG抗体,玻板凝集试验证实缺失株免疫血清无凝集抗体产生。因此,S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG缺失株具有较好的免疫原性,且不产生凝集抗体。3.鸡白痢沙门菌基因缺失株的免疫效力试验根据免疫保护评价筛选出S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG进行免疫效力评价,免疫后7、14和2l天分别采集血清进行间接ELISA检测,免疫后7天可检测到阳性抗体,第21天IgG抗体阳性率接近100%。采集外周血进行流式细胞术检测,结果显示,免疫14天后S6702△rfaL免疫组的鸡外周血内CD4+、CD8+T淋巴细胞比例上升,表明细胞免疫水平有所提高。疫苗组体内分布试验表明,在免疫21天后,在鸡肝脏和脾脏内的缺失株细菌基本被清除。免疫保护试验显示,S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG的保护率分别为80%、80%和70%。综上所述,减毒株S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG既能诱导SPF鸡产生较强的体液免疫应答,又可激活细胞免疫,具有良好的免疫保护效果,同时还不产生血清凝集抗体,可作为鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31

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本文编号：1211487