检测大肠杆菌菌毛的新型凝集技术研究

发布时间：2017-11-23 23:26

  本文关键词：检测大肠杆菌菌毛的新型凝集技术研究

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【摘要】：产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)作为最主要的肠道病原菌,常引起犊牛、羔羊、仔猪等幼畜腹泻,在世界大部分地区广泛流行,具有高发病率和死亡率,给畜牧业带来严重的损失,因此建立一种快速、简便、灵敏、特异的诊断技术对防治该病具有重要意义。ETEC可在菌毛黏附素协助下定植在肠道内,继而产生肠毒素,引起幼畜腹泻。许多ETEC菌株带有菌毛黏附素,如K88、K99、987p和F41,因此,通过快速检测菌毛黏附素,可为ETEC的检测提供重要的参考依据。本研究旨在通过提取ETEC菌毛K88ab、K99、987p和F41,免疫新西兰白兔制备单因子血清;以彩色二氧化硅微球(Colored Silica Nanoparticles,CSN)为载体,将单因子血清修饰到微球表面,制备免疫彩色二氧化硅微球(Immune Colored Silica Nanoparticles,ICSN),建立一种新型间接凝集技术用于K88ab、K99、987p和F41菌毛的快速检测。单因子血清的制备。分别提取四种菌毛,免疫新西兰白兔,每隔21 d免疫一次,共免疫3次;无菌采集兔心血制备抗血清,玻片凝集试验结果显示,抗K88ab、K99、987p和F41血清凝集价分别为1:256、1:512、1:128和1:4096。交叉凝集试验结果显示,K88ab抗血清与K99抗原凝集价为1:32,K99、987p和F41抗血清均与K88抗原交叉凝集,凝集价分别为1:8、1:16和1:16。通过反应条件优化,最终确定将抗血清和与之有交叉凝集的菌体压积1:1混合,4℃48h吸收交叉抗体。结果显示,吸收后的抗K88ab、K99、987p和F41血清只与自身抗原发生凝集反应,特异性良好,凝集价分别为1:64、1:256、1:32和1:2048。ICSN的制备及应用。用反相微乳液法制备的CSN与单因子血清结合制备了不同颜色的K88ab、K99、987p和F41 ICSN,同时使用三种不同颜色的ICSN检测抗原,结果显示颜色对凝集效果没有影响。通过反应条件优化,最终确定玻片凝集试验的反应体系和反应条件为:ICSN 20μL、菌液20μL(菌液浓度范围为106~109CFU?m L-1),25℃~37℃反应1 min。特异性实验结果显示,K88ab、K99、987p和F41 ICSN与ETEC C83903(K88ab+)、C82529(K99+)、C83915(987p+)、O142(F41+)、大肠杆菌DN69-A、大肠杆菌DN89-B、绿脓杆菌(SD004)、猪丹毒杆菌(CVCC124)、猪霍乱沙门氏菌(CVCC503)、巴氏杆菌(CVCC430)、生理盐水不发生交叉凝集反应。敏感性实验结果显示,K88ab、K99、987p和F41 ICSN对菌液的最小检出浓度为1.0~5.1×106CFU?m L-1。制备的ICSN在4℃保存30 d,其特异性、敏感性没有明显变化,具有良好的稳定性。对双盲样品的检测结果同实际样品的检测结果,100%符合。新型凝集试验结果直观、易于判断,且每次使用的抗体量为玻片凝集试验的1/500,适用于抗体量少而检测样品多的情况。本研究建立了一种以CSN为载体,用于检测ETEC K88ab、K99、987p、F41菌毛的新型间接凝集试验,为幼畜大肠杆菌性腹泻的诊断与防治提供了简便、快速、敏感、特异的检测方法。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
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本文编号：1220248