宿主凋亡相关斑点样蛋白在羊口疮病毒致炎中的作用研究

发布时间：2017-11-25 10:07

  本文关键词：宿主凋亡相关斑点样蛋白在羊口疮病毒致炎中的作用研究

  更多相关文章： 羊口疮病毒 宿主 ASC 相互作用

【摘要】：羊口疮,又称羊传染性脓疱皮炎,是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的人兽共患传染病,主要发生于绵羊、山羊、多种野生动物和人。特征性病变是在唇、口、鼻等部位出现红斑、丘疹、脓疱和痂皮。羊口疮病毒在世界范围内广泛分布,凡是养羊地区均有该病的发生和流行。中国除传统的养羊区如东北、西北地区均有该病的发生和流行外,山东、广东、云南等地也出现该病的发生和流行。虽然羊口疮病毒对人危害性不大,但是由于其高感染率和分布广泛,给畜牧业造成巨大的经济损失。ORFV自身能够产生抗炎蛋白来逃避宿主免疫反应,引起宿主重复发病。由于缺乏有效的防控措施以及对ORFV介导宿主免疫和致病机制了解不足,该病在羊群中频繁暴发流行。凋亡相关斑点样蛋白是炎症小体重要接头蛋白,在炎症小体介导的抵抗病原微生物感染中具有重要作用。目前,还没有关于凋亡相关斑点样蛋白在ORFV感染中的作用研究,这严重妨碍了ORFV介导宿主免疫和致病机制的深入研究。因此,本文进行了如下研究:1、羊口疮病毒广东增城株的分离与鉴定利用OFTu细胞从广东增城某疑似发病黑山羊痂皮组织中分离羊口疮病毒,通过观察细胞病变形态、测定病毒滴度和聚合酶链式反应(PCR)等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料接种于OFTu细胞后盲传至第四代出现典型病变;测得第五代病毒滴度为108.65TCID50/mL;扩增出羊口疮病毒特异性基因ORFV011、ORFV059、ORFV109、ORFV110和ORFV127;系统进化分析表明分离的羊口疮病毒与羊口疮病毒FJ-DS和FJ-GT亲缘关系较近。以上结果说明成功分离到羊口疮病毒,将其命名为ORFV-GDZC株。2、海南黑山羊ASC基因克隆及序列分析运用RT-PCR方法扩增了海南黑山羊ASC基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序,对获得的基因序列提交到GenBank,获得accession no:KM576770。运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析,结果显示,所克隆的海南黑山羊ASC基因编码196个氨基酸,蛋白分子量约为22.1 kDa。通过DNASTAR软件对不同物种的ASC基因序列和氨基酸序列进行同源性分析,海南黑山羊ASC基因与牛、人、猪、猕猴、小鼠、大鼠、非洲爪蟾和斑马鱼的同源性分别为95.2%、81.3%、83.0%、79.8%、75.4%、75.1%、49.2%、43.7%,该基因在哺乳类动物间的同源性高,和两栖类动物间的同源性低,仅有50%。3、海南黑山羊ASC的原核表达与多抗制备通过双酶切和序列测定证明成功构建了pET32a(+)-ASC表达质粒。ASC-His标签重组融合蛋白得到有效表达,通过SDS蛋白凝胶电泳检测纯化蛋白条带大小约为40kDa,与其预测的大小相一致。用His标签抗体和免疫家兔制备的纯化IgG抗体分别进行Western blot检测,结果表明表达的融合蛋白均为ASC-His标签重组融合蛋白。4、ASC真核过表达载体和RNAi干扰载体构建以克隆质粒pMD18-T-C-ASC为模板,设计特异性引物,构建pIRES2-EGFP-ASC真核过表达质粒。将pIRES2-EGFP-ASC转染OFTu细胞,经荧光显微观察和IFA检测,可观察到非常强的绿色荧光,表明过表达载体构建成功。利用生物学软件,设计ASC基因的寡核苷酸引物,构建了pSuper-shASC干扰载体。通过shRNA干扰质粒转染实现ASC在OFTu细胞内的沉默表达,荧光定量PCR检测结果显示转染shRNA-ASC24h内ASC mRNA表达抑制效率达60%。5、ASC在ORFV感染宿主细胞致炎中的作用研究首先,利用荧光定量PCR方法对ORFV感染不同时间段(1、2、3、4、6、12、24h)OFTu细胞中ASC基因以及宿主细胞炎性因子的表达变化规律进行分析。结果表明,ASC基因及宿主细胞炎性因子在病毒感染早期表达量上调,在感染后2h mRNA表达量最高,激活了宿主炎症免疫反应。为进一步分析ASC在ORFV感染过程中的功能,本研究将ORFV分别感染ASC过表达及抑制表达OFTu细胞,利用荧光定量PCR检测宿主炎性因子变化,结果表明ASC在宿主抗病毒过程中发挥重要作用。
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 张凯照;于梦;宁章勇;;羊口疮病毒活载体疫苗和生物制剂的研制现状[J];中国畜牧兽医;2015年09期

2 王晴楠;张凯照;宁章勇;;我国1984-2014年羊口疮报道文献的统计分析[J];畜牧与兽医;2015年09期

3 鲜思美;吴健;杨钰;刘宗胜;刘嫒;苏刚;;琼脂扩散试验检测羊口疮病毒[J];中国兽医杂志;2014年08期

4 徐俊;毛颖;苗荻;郝佳;;RNA干扰技术的研究进展[J];生物技术世界;2012年03期

5 史宗勇;史新涛;古少鹏;郑明学;;羊传染性脓疱研究进展[J];养殖与饲料;2010年11期

6 王宝安,许益民,石火英,吴力力;山羊传染性脓疱的病理学诊断[J];江苏农学院学报;1998年04期

7 薛掌林;薛双虎;吕武夫;赵立志;王廷璞;;中和试验对羊传染性脓疱皮炎抗体的检测[J];甘肃畜牧兽医;1990年02期

，

本文编号：1225627